針刺、TENS治療對大鼠深Ⅱ度燒傷的中性粒細(xì)胞凋亡的差異性影響

程 潔,朱 毅

(南京中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院,江蘇南京 210046)

創(chuàng)傷愈合是一個(gè)復(fù)雜的生理生化以及分子生物學(xué)過程,炎癥和免疫反應(yīng)是創(chuàng)面愈合過程中重要的病理生理變化。燒傷創(chuàng)面早期存在進(jìn)行損害,使創(chuàng)面加深,防止或減輕創(chuàng)面的早期進(jìn)行性損害,將有利于創(chuàng)面愈合。已有實(shí)驗(yàn)研究[1]顯示：針刺有促進(jìn)燒傷創(chuàng)面的愈合作用,其作用機(jī)制可能是多方面的,其中與減輕燒傷創(chuàng)面早期水腫、改善創(chuàng)面微循環(huán)、進(jìn)而減輕創(chuàng)面早期進(jìn)行性損害有關(guān)。經(jīng)皮電刺激神經(jīng)療法(TENS)能改善局部血運(yùn),促進(jìn)水腫吸收,緩解疼痛。

中性粒細(xì)胞(polymorphonuclear neutrophil,PMN)在失控性全身炎癥(systemic inflammatory response syndrome,SIRS)反應(yīng)中的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸起著關(guān)鍵作用,且凋亡是清除 PMN的非炎癥方式,可以有效地避免周圍組織損傷[2]。本實(shí)驗(yàn)旨在探討針刺、局部TENS治療對大鼠中性粒細(xì)胞影響及對燒傷 SIRS的干預(yù)防治作用。

1 材料與方法

1.1 材料

恒溫恒壓燙傷儀;Percoll淋巴細(xì)胞分離液;Pextran-75000(phaimacia);Annexin V-FITC試劑盒;戊巴比妥鈉及流式細(xì)胞儀分析。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與模型制備

清潔級 SD大鼠 40只,體重 230～250 g,由香港理工大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,隨機(jī)分成 4組：針刺組(n=10),TENS組(n=10),燒傷組(n=10),空白組(n=10)。燒傷造模,以 100 ml/l水和氯醛液經(jīng)腹腔內(nèi)注射麻醉(30 mg/kg),背部脫毛,次日同法麻醉。用恒溫恒壓燙傷儀以直徑 2.5 cm,90℃,2.3 KPa壓力燙傷大鼠背部皮膚 15 s,制成 2.5 cm的深 II度創(chuàng)面 1個(gè)(經(jīng)病理驗(yàn)證)。

1.2.2 治療

30只經(jīng)燒傷造模的實(shí)驗(yàn)大鼠,予乳酸林格氏液(50 ml/kg)抗休克。針刺組在造模后立即取大鼠雙側(cè)“足三里”(李忠仁《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》)。常規(guī)消毒,針刺后接電針儀,頻率 20 Hz,強(qiáng)度 2～4 mA,電壓 1～3 V,斷續(xù)波。強(qiáng)度以保持針刺局部輕微抖動(dòng)為度,治療時(shí)間30 min。

TENS組在造模后,在燒傷創(chuàng)面四周健康皮膚(距離創(chuàng)面邊緣約 0.5 cm)擺放雙通道 4個(gè) TENS電極,電流強(qiáng)度 4 mA,治療時(shí)間 30 min。

空白組不做任何處理,大鼠自由飲水,進(jìn)食。

1.2.3 標(biāo)本的取材和處理

燒傷組、針刺組、TENS組在建模成功后 24 h心臟取血 5 ml,之后放血處死。取其后肢雙側(cè)股骨,用肝素、生理鹽水 10 ml沖洗骨髓腔。收集 10 ml于玻璃瓶中反復(fù)抽打成單細(xì)胞懸液,以常規(guī)方式分離周圍血中和骨髓中中性粒細(xì)胞。以流式細(xì)胞儀檢測周圍血中和骨髓中性粒細(xì)胞的凋亡和壞死。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 燒傷造模 24 h后骨髓中性粒細(xì)胞的凋亡率

燒傷造模 24 h后骨髓中性粒細(xì)胞凋亡率針刺組較 TENS組、燒傷組有明顯增加。見表1。各組數(shù)據(jù)經(jīng)方差分析總體有顯著性差異(P＜0.05),兩兩比較亦有顯著性差異(P＜0.05)。

表1 各組在造模24 h后骨髓 PMN的凋亡率

2.2 燒傷造模 24 h后周圍血中中性粒細(xì)胞的凋亡率

燒傷造模 24 h后周圍血中性粒細(xì)胞凋亡率針刺組較 TENS組、燒傷組有明顯增加。見表 2。各組數(shù)據(jù)經(jīng)方差分析,總體上有顯著性差異(P＜0.05);兩兩比較,TENS組與燒傷組無顯著性差異(P＞0.05),針刺組與燒傷組比較、針刺組與 TENS組比較均有顯著性差異(P＜0.05)。

表2 各組 24 h后周圍血中PMN的凋亡率

3 討論

燒傷創(chuàng)口愈合是一種病理愈合,在病理情況下傷口愈合延緩,主要是炎癥過程和機(jī)體免疫功能失調(diào)。在傷后愈合的早期表現(xiàn)出機(jī)體炎癥反應(yīng)異?；?和免疫功能抑制。

燒傷早期重要的病理變化就是中性粒細(xì)胞(PMN)在失控性全身炎癥反應(yīng)(SIRS)中發(fā)展預(yù)后中起著重要作用。

燒傷后周圍血中中性粒細(xì)胞增多主要是由于燒傷后邊緣池中性粒細(xì)胞釋放入循環(huán)池和骨髓生成釋放中性粒細(xì)胞增多以及體液丟失血液濃縮所致。張丕紅等[3]發(fā)現(xiàn),燒傷早期中性粒細(xì)胞凋亡明顯減少。這可能是燒傷早期中性粒細(xì)胞數(shù)目增加的重要機(jī)制之一。燒傷后骨髓中中性粒細(xì)胞加快釋放入血且血漿抑制中性粒細(xì)胞凋亡[4],進(jìn)而使周圍血中中性粒細(xì)胞數(shù)目增加。實(shí)驗(yàn)觀察針刺可以促進(jìn)燒傷大鼠周圍血中中性粒的凋亡,進(jìn)而使周圍血中中性粒細(xì)胞數(shù)目相對減少,從而減輕炎癥反應(yīng)以及臟器損害。

總之,中性粒細(xì)胞是 SIRS的重要參與者,其凋亡延遲導(dǎo)致了組織損傷。本次實(shí)驗(yàn)中,針刺“足三里”既能促進(jìn)骨髓中性粒細(xì)胞的凋亡,減少其釋放入血,又能直接促進(jìn)外周血的中性粒細(xì)胞凋亡,從而減輕炎癥反應(yīng)以及臟器損害。這有力證實(shí)了針刺這一外治療法在對于燒傷后全身免疫機(jī)制的調(diào)節(jié)。局部 TENS治療則能促進(jìn)外周血中性粒細(xì)胞的凋亡,對骨髓中性粒細(xì)胞沒有顯著影響,但在一定程度上也對臨床治療有指導(dǎo)意義。

[1] 謝有富,葉慧貞,梁佩紅,等.針刺對深 II度燒傷創(chuàng)面愈合的影響[J].新中醫(yī),2000,32(10)：22

[2] 羅志剛,皇子通.中性粒細(xì)胞凋亡與多器官功能障礙綜合癥[J].嶺南急診醫(yī)學(xué)雜志,2007,12(6)：478-479

[3] 張丕紅,馬恩慶,黃曉元,等.家兔燙傷早期中性粒細(xì)胞凋亡變化[J].中華外科雜志,1999,37(12)：771-773

[4] Chitnis D,Dickerson C,Munster AM,el al.Inhibition of apoptosis in polymorphonuclear neutrophils from burn patients[J].J Leukoc Biol,1996,59(6)：835-839