牛奶中三價(jià)鉻和六價(jià)鉻的同時(shí)提取和檢測(cè)方法

李 靜，王 雨，陳華寶，梁立娜*

(戴安中國(guó)有限公司應(yīng)用研究中心，北京 100085)

牛奶中三價(jià)鉻和六價(jià)鉻的同時(shí)提取和檢測(cè)方法

李 靜，王 雨，陳華寶，梁立娜*

(戴安中國(guó)有限公司應(yīng)用研究中心，北京 100085)

建立牛奶中三價(jià)鉻和六價(jià)鉻的同時(shí)提取和測(cè)定方法。前處理過(guò)程中一次完成六價(jià)鉻的提取、有機(jī)鉻中三價(jià)鉻的釋放、三價(jià)鉻柱前衍生以及牛奶蛋白沉降。鉻的提取效率高，牛奶基體去除效果好，操作簡(jiǎn)單方便。使用IonPac CS5A色譜柱可以在8min內(nèi)完成牛奶中兩種鉻的價(jià)態(tài)分析，三價(jià)鉻和六價(jià)鉻分別以PDCA和DPC作為絡(luò)合劑，分別在紫外和可見(jiàn)波長(zhǎng)下采用UV-Vis檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，靈敏度高，基體干擾小。為牛奶的質(zhì)量檢測(cè)提供了準(zhǔn)確實(shí)用的方法。

三價(jià)鉻；六價(jià)鉻；離子色譜；UV-Vis檢測(cè)；牛奶質(zhì)量檢測(cè)

日前，某乳業(yè)公司多批次牛奶中被檢出一種名為“皮革水解蛋白粉”的物質(zhì)，該物質(zhì)的生產(chǎn)原料是制革廠的邊角廢料，由于制革過(guò)程中需要大量的三價(jià)鉻作為鉻鞣劑[1]，因此皮革水解蛋白即使經(jīng)過(guò)脫鉻處理也會(huì)存在一定量的重金屬鉻[2-3]。這些鉻主要以Cr(Ⅲ)和Cr (Ⅵ)的形態(tài)存在，六價(jià)鉻具有很強(qiáng)的毒性，可干擾重要的酶體系，具有致癌和誘發(fā)基因突變的作用[4-5]。三價(jià)鉻是人體的一種必需微量元素，在正常食品補(bǔ)給劑量下，三價(jià)鉻是無(wú)毒的[6]，但較高劑量的三價(jià)鉻仍表現(xiàn)出細(xì)胞毒性反應(yīng)，長(zhǎng)期的累積毒性還有待于進(jìn)一步的研究[7]。由于三價(jià)鉻和六價(jià)鉻可以通過(guò)氧化還原作用相互轉(zhuǎn)化[8]，并且都具有一定毒性，因此對(duì)于含“皮革水解蛋白粉”的乳制品，同時(shí)檢測(cè)其中三價(jià)鉻和六價(jià)鉻的含量具有重要意義。

原子吸收和發(fā)射光譜等方法只能檢測(cè)鉻的總量；直接分光光度法檢測(cè)時(shí)兩種鉻精確度難以保證。有文獻(xiàn)報(bào)道用離子色譜分離，UV或電感耦合等離子體質(zhì)譜同時(shí)檢測(cè)三價(jià)鉻和六價(jià)鉻[9-10]，用UV檢測(cè)的方法中六價(jià)鉻沒(méi)有經(jīng)過(guò)絡(luò)合，因而靈敏度較低。本方法中對(duì)三價(jià)鉻和六價(jià)鉻分別進(jìn)行柱前和柱后衍生，并分別在紫外和可見(jiàn)波長(zhǎng)條件下采用UV-Vis檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，以提高兩種鉻的檢測(cè)靈敏度。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

牛奶 市售。

吡啶-2,6-二羧酸(PDCA，純度99%) Aldrich公司；1,5-二苯卡巴肼(DPC，分析純) 新中化學(xué)廠；

Na2HPO4·12H2O(分析純) 國(guó)藥集團(tuán)；NaI·2H2O(優(yōu)級(jí)純) 津科精細(xì)化工；CH3COONH4(分析純) 北京化學(xué)試劑公司；LiOH(56%) ACROS公司；甲醇(色譜純)、硫酸(95%～98%)、硝酸(65%～68%)均為優(yōu)級(jí)純 北京化工廠；Cr(Ⅲ)、Cr(Ⅵ)標(biāo)準(zhǔn)試劑 百靈威公司；超純水(電阻率18.2MΩ/cm)；0.22μm尼龍濾膜 天津賀世科技發(fā)展有限公司。

ICS-3000離子色譜儀、Ultimate 3000可變波長(zhǎng)紫外可見(jiàn)檢測(cè)器、PC-10柱后衍生裝置、375μL編結(jié)反應(yīng)管、OnGuardⅡRP前處理柱(1.0mL) 美國(guó)Dionex公司。

1.2 色譜條件

色譜柱：IonPac C S5A(4mm×250mm)分析柱、IonPac CG5A(4mm×50mm)保護(hù)柱；淋洗液：2mmol/L PDCA、2mmol/L Na2HPO4、10mmol/L NaI、50mmol/L CH3COONH4、2.8mmol/L LiOH混合水溶液；衍生試劑：2mmol/L DPC、10%(V/V)甲醇、2.5%(V/V)硫酸；淋洗液流速：1.0mL/min；衍生液流速：0.5mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：0～4.3min、365nm (Cr(Ⅲ)檢測(cè)波長(zhǎng))，4.3～8min、530nm (Cr(Ⅵ)檢測(cè)波長(zhǎng))。

1.3 溶液配制

1.3.1 淋洗液儲(chǔ)備液的配制

配制20mmol/L吡啶-2,6-二羧酸(PDCA)、20mmol/L Na2HPO4、100mmol/L NaI、500mmol/L CH3COONH4和28.0mmol/L LiOH混合水溶液。PDCA溶解速度較慢，可略微加熱促進(jìn)其溶解，所有溶質(zhì)完全溶解后真空抽濾，濾去不溶性雜質(zhì)。

1.3.2 淋洗液的配制

將100mL淋洗液儲(chǔ)備液用超純水稀釋到1L，稀釋后淋洗液的pH值應(yīng)在6.70～6.80之間。

1.3.3 柱后衍生液的配制

將0.5g 1,5-二苯卡巴肼(DPC)溶解在100mL甲醇中。在約500mL去離子水中加入濃硫酸25mL。將上述兩種溶液混合，并用超純水準(zhǔn)確定容至1L，所得溶液真空抽濾，濾去不溶性雜質(zhì)。

1.3.4 三價(jià)鉻和六價(jià)鉻混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

取1000mg/L的三價(jià)鉻標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0mL，1000mg/L的六價(jià)鉻標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1mL，置于同一個(gè)50mL的容量瓶中，用超純水稀釋至刻度，該溶液中三價(jià)鉻質(zhì)量濃度為20mg/L，六價(jià)鉻質(zhì)量濃度為2mg/L。

分別取上述溶液0.025、0.05、0.1、0.25、0.5、1.0、2.5、5.0mL于8個(gè)10mL容量瓶中，再分別加入1mL淋洗液儲(chǔ)備液，煮沸1min，溶液體積較少時(shí)，可加入1mL超純水以免煮干，冷卻后定容至刻度，獲得兩種鉻的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列。

1.3.5 樣品溶液的制備

在一個(gè)50mL容量瓶中，按順序加入牛奶或牛奶加標(biāo)樣品0.5mL，超純水4.5mL，淋洗液儲(chǔ)備液5mL，33%硝酸0.1mL，煮沸2～3min，冷卻定容后過(guò)0.22μm濾膜和OnGuard Ⅱ RP前處理柱，流出液棄去前面的3mL，收集后面流出液用于進(jìn)樣。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離條件和檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

利用吡啶二羧酸鉻(CrⅢ-PDCA)的紫外吸收和二苯卡巴肼鉻(CrⅥ-DPC)在可見(jiàn)光區(qū)的吸收來(lái)進(jìn)行檢測(cè)。由于三價(jià)鉻的配位交換的動(dòng)力較弱，所以需要進(jìn)行柱前衍生生成Cr(Ⅲ)-PDCA，進(jìn)樣后在分析柱中以Cr(PDCA)2－的形式被分離，而六價(jià)鉻則以鉻酸根離子(CrO42－)的形式被分離出來(lái)。在分離之后再采用柱后衍生生成Cr(Ⅵ)-DPC，兩種物質(zhì)在不同波長(zhǎng)處進(jìn)行檢測(cè)。

本實(shí)驗(yàn)中三價(jià)鉻的檢測(cè)波長(zhǎng)為365nm，這雖不是三價(jià)鉻的最大吸收波長(zhǎng)，但在該波長(zhǎng)處檢測(cè)可以有效避免牛奶基體對(duì)三價(jià)鉻檢測(cè)的干擾。

兩種鉻的標(biāo)準(zhǔn)品分離譜圖和牛奶加標(biāo)樣品分離譜圖見(jiàn)圖1和圖2。由圖2可見(jiàn)，牛奶基體對(duì)兩種鉻的檢測(cè)都沒(méi)有干擾，分析快速準(zhǔn)確。

圖1 三價(jià)鉻和六價(jià)鉻標(biāo)準(zhǔn)品分離譜圖Fig.1 Chromatogram of mixed chromium (Ⅲ) and chromium (Ⅵ) standards

圖2 牛奶加標(biāo)樣品分離譜圖Fig.2 Chromatogram of a spiked milk sample

2.2 前處理方法的研究

文獻(xiàn)報(bào)道中三價(jià)鉻和六價(jià)鉻的檢測(cè)基體一般為電鍍廢液、制革廢水等，三價(jià)鉻和六價(jià)鉻都以游離的離子

狀態(tài)存在。而牛奶中的三價(jià)鉻會(huì)與蛋白質(zhì)上的羧基發(fā)生鍵合反應(yīng)生成有機(jī)鉻[2,6]，因此在沉降蛋白之前需要將三價(jià)鉻釋放出來(lái)。PDCA是三價(jià)鉻的絡(luò)合劑，將牛奶稀釋10倍后，與等量的淋洗液儲(chǔ)備液混合并加熱，淋洗液儲(chǔ)備液中的PDCA就可以與三價(jià)鉻結(jié)合，以離子形式存在于溶液中，這個(gè)過(guò)程也同時(shí)完成了三價(jià)鉻的柱前衍生，鉻酸根離子由該溶液同時(shí)提取。加入淋洗液儲(chǔ)備液之后，再加入少量的硝酸，煮沸，牛奶中的蛋白會(huì)發(fā)生沉降，將該溶液定容到一定體積后，經(jīng)過(guò)0.22μm濾膜和On Guard Ⅱ RP前處理柱就可以獲得澄清的溶液。

2.3 線性范圍、相關(guān)系數(shù)、最小檢出限

采用1.3.4節(jié)中制備的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別對(duì)三價(jià)鉻和六價(jià)鉻8個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣，考察三價(jià)鉻和六價(jià)鉻在0.05～10mg/L和0.005～1mg/L內(nèi)質(zhì)量濃度與峰面積的線性關(guān)系，兩者的線性方程分別為y＝1.3965x－0.003和y＝82.6474x－0.012[其中，y為峰面積，x為組分的質(zhì)量濃度/(mg/L)]，相關(guān)系數(shù)均為0.9999。

以信噪比3:1為檢出限，三價(jià)鉻和六價(jià)鉻的最小檢出質(zhì)量濃度分別為23.3μg/L和0.4μg/L。以信噪比10:1為定量限，三價(jià)鉻和六價(jià)鉻的最小定量質(zhì)量濃度分別為77.5μg/L和1.3μg/L。

2.4 方法重現(xiàn)性

取三價(jià)鉻和六價(jià)鉻質(zhì)量濃度為0.5mg/L和0.05mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為2.3%和1.1%。

2.5 樣品分析和回收率

為了考察本方法對(duì)實(shí)際牛奶樣品的分析效果，檢測(cè)了市場(chǎng)上購(gòu)買(mǎi)到的幾種純牛奶，均不含有三價(jià)鉻和六價(jià)鉻，故需向牛奶中添加一定量的三價(jià)鉻和六價(jià)鉻，進(jìn)行加標(biāo)回收率測(cè)定。選擇某品牌純牛奶，向其中加入一定量的三價(jià)鉻標(biāo)準(zhǔn)溶液，加標(biāo)回收率見(jiàn)表1。三價(jià)鉻的回收率良好，該方法對(duì)三價(jià)鉻的測(cè)定準(zhǔn)確可靠。

表1 三價(jià)鉻加標(biāo)回收率Table 1 Recoveries for chromium (Ⅲ) in a commercial milk sample (neither chromium (Ⅲ) and chromium (Ⅵ) detected) spiked at 3 levels

在5mL (V牛奶)牛奶中加入一定體積(V加)的1000mg/L (cCrⅥ標(biāo))的六價(jià)鉻標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.3.5節(jié)的前處理方法和1.2節(jié)的色譜條件進(jìn)行分析，加標(biāo)回收結(jié)果見(jiàn)表2?？梢?jiàn)，實(shí)測(cè)值(c實(shí))與添加水平(c加)不相等，其差值接近一個(gè)恒定的數(shù)值(c差)。由于六價(jià)鉻的定量限可達(dá)0.0013mg/L，因此加入水平為0.04mg/L時(shí)，應(yīng)該就可以檢測(cè)到一個(gè)比較高的色譜峰，但在加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)中根本檢測(cè)不到六價(jià)鉻，卻檢測(cè)到了三價(jià)鉻，其他加標(biāo)水平中三價(jià)鉻的檢出量基本等于六價(jià)鉻的減少量。這是因?yàn)榕Ｄ讨写嬖谝恍┨烊坏倪€原性物質(zhì)[11]，會(huì)使六價(jià)鉻定量的還原為三價(jià)鉻，如果設(shè)這種還原性物質(zhì)的質(zhì)量濃度為a(mg/L)，通過(guò)下式可以計(jì)算出a值，其值也接近一個(gè)常數(shù)。

(V加×cCrⅥ標(biāo))－(a×V牛奶)= c差×V牛奶

表2 5mL牛奶中六價(jià)鉻加標(biāo)回收數(shù)據(jù)Table 2 Recoveries for chromium chromium (Ⅵ) in 5 mL of a blank milk sample spiked at 5 levels

為了進(jìn)一步證明牛奶中還原性物質(zhì)的存在，以及它對(duì)六價(jià)鉻的影響，在所有前處理方法和檢測(cè)方法不變的情況下，向2.5mL牛奶中添加六價(jià)鉻標(biāo)準(zhǔn)溶液，那么2.5mL牛奶使六價(jià)鉻的減少質(zhì)量(m差)應(yīng)為5mL牛奶的一半，加標(biāo)回收數(shù)據(jù)見(jiàn)表3。

表3 2.5mL牛奶中六價(jià)鉻加標(biāo)回收數(shù)據(jù)Table 3 Recoveries for chromium chromium (Ⅵ) in 2.5 mL of a blank milk sample spiked at 5 levels

由表3可見(jiàn)，2.5mL牛奶中六價(jià)鉻的減少量(m差)近似為5mL牛奶減少量的一半，并且計(jì)算得到的a值也近似相等。證明了六價(jià)鉻的回收率降低是由牛奶中還原性物質(zhì)引起的，進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，不同品牌牛奶中該還原性物質(zhì)的濃度可能有較大差別。

本方法使用的牛奶均為不添加任何抗氧化劑的純牛奶，還原性物質(zhì)是牛奶中天然存在的，但牛奶中人為添加的還原性物質(zhì)同樣可以使六價(jià)鉻轉(zhuǎn)化為三價(jià)鉻。因此添加了皮革水解蛋白的牛奶，必須同時(shí)檢測(cè)其中三價(jià)

鉻和六價(jià)鉻的含量，所得數(shù)據(jù)才能比較正確地反映牛奶中六價(jià)鉻的加入量。

但是有些配方奶粉中確實(shí)添加了三價(jià)鉻作為有益微量元素，這時(shí)是否檢測(cè)到六價(jià)鉻是牛奶中三價(jià)鉻來(lái)源的判斷依據(jù)，因此需要對(duì)三價(jià)鉻和六價(jià)鉻進(jìn)行分別檢測(cè)。本方法對(duì)六價(jià)鉻的檢出限很低，只要檢測(cè)到六價(jià)鉻，就可以對(duì)三價(jià)鉻的來(lái)源進(jìn)行判斷。同時(shí)正常牛奶中含三價(jià)鉻5～16μg/kg[12]，如果檢測(cè)到三價(jià)鉻含量異常升高，也應(yīng)對(duì)三價(jià)鉻來(lái)源進(jìn)行進(jìn)一步確認(rèn)。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)建立了一種牛奶中三價(jià)鉻和六價(jià)鉻的同時(shí)提取和測(cè)定方法，前處理方法高效簡(jiǎn)單快速，檢測(cè)方法靈敏準(zhǔn)確，并且應(yīng)用該方法對(duì)牛奶中三價(jià)鉻和六價(jià)鉻的存在方式，以及與牛奶中物質(zhì)的相互作用等方面進(jìn)行了系統(tǒng)的研究。結(jié)果表明對(duì)于添加皮革水解蛋白的牛奶，需要同時(shí)檢測(cè)三價(jià)鉻和六價(jià)鉻的含量，并給出了判斷三價(jià)鉻來(lái)源的依據(jù)。為牛奶的質(zhì)量檢測(cè)提供了準(zhǔn)確實(shí)用的方法。

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Simultaneous Extraction and Determination of Chromium (Ⅲ) and Chromium (Ⅵ) in Milk

LI Jing，WANG Yu，CHEN Hua-bao，LIANG Li-na*
(Application Research Center, Dionex China, Beijing 100085, China)

A method was developed for the simultaneous extraction and determination of chromium (Ⅲ) and chromium (Ⅵ) in milk. One pretreatment process was required for chromium (Ⅵ) extraction, the release of chromium (Ⅲ) from organic chromium, chromium (Ⅲ) pre-column derivatization and milk protein sedimentation, which exhibited simplicity, convenience and high extraction efficiency of chromium. The separation of chromium (Ⅲ) and chromium (Ⅵ) was achieved on an IonPac CS5A column within 8 min. Chromium (Ⅲ) and chromium (Ⅵ) were chleated with PDCA and DPC and were detected with a UV-Vis detector at UV and visible wavelengths, respectively. This work provides an accurate and practical method for milk quality evaluation.

chromium (Ⅲ)；chromium (Ⅵ)；ion chromatography；UV-Vis detection；milk quality testing

O657.32

A

1002-6630(2010)10-0250-04

2009-07-04

李靜(1982—)，女，碩士，研究方向?yàn)殡x子色譜分析。E-mail：lijing@dionex.com.cn

*通信作者：梁立娜(1976—)，女，博士，研究方向?yàn)橐合嗉半x子色譜分析。E-mail：lianglina@rcees.ac.cn