豬肚菇子實體發(fā)育過程中抗氧化酶活性的變化

董洪新，程顯好，朱 林，蔡德華，李 玉*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)菌物研究所，吉林 長春 130118；2.魯東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 煙臺 264025)

豬肚菇子實體發(fā)育過程中抗氧化酶活性的變化

董洪新1,2，程顯好2，朱 林2，蔡德華2，李 玉1,*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)菌物研究所，吉林 長春 130118；2.魯東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 煙臺 264025)

研究豬肚菇子實體不同發(fā)育時期膜脂過氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)的活性變化情況。結(jié)果表明：隨著豬肚菇子實體生長和衰老，子實體中MDA逐漸積累，膜脂過氧化程度加重；SOD和CAT活性先升高后降低，SOD、CAT活性最高值分別出現(xiàn)在杯形期和釘頭期，而POD活性則基本穩(wěn)定。因此，活性氧代謝失調(diào)引發(fā)的生物膜結(jié)構(gòu)破壞是豬肚菇子實體衰老的重要原因之一。關(guān)鍵詞：豬肚菇；子實體；發(fā)育；抗氧化酶

自由基學(xué)說認為，生物衰老過程是活性氧大量積累與代謝失調(diào)的過程[1]。近來研究發(fā)現(xiàn)活性氧可能作為第二信使參與生物體內(nèi)的代謝及生命活動[2]。生物在正?；蚍钦４x進程中可通過多種途徑產(chǎn)生活性氧自由基，同時它們又存在著清除這些自由基的機制, 包括保護酶系統(tǒng)，如過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)等和非保護酶系統(tǒng)，如VC、類胡蘿卜素、VE等。生物種類的不同，表現(xiàn)出活性氧代謝各因素間相互作用的復(fù)雜性和多樣性。近來關(guān)于抗氧化酶活性的相關(guān)研究報道多集中在小麥、果蔬、花卉等植物上[3-5]，而對衰老過程中食用菌子實體抗氧化酶的響應(yīng)及調(diào)節(jié)機理則未見報道。

豬肚菇(Panus giganteus)又名大杯香菇、大革耳等，是國內(nèi)近年來新開發(fā)的一種珍稀食用菌，其口感風(fēng)味獨特，有豬肚般的滑膩，因此而得其商品名[6-7]。豬肚菇子實體的菌肉肥厚，質(zhì)地細膩，脆嫩可口，湯汁鮮美營養(yǎng)豐富，其生長條件粗獷，適用原料廣泛，且在夏季出菇，對于解決食用菌生產(chǎn)淡季和調(diào)節(jié)市場供應(yīng)很有意義，具有廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景。豬肚菇子實體發(fā)育和衰老過程中，在形態(tài)上有典型的4個時期，可以代表其發(fā)育和衰老的不同階段，是研究子實體發(fā)育和衰老的好材料。大型真菌子實體的形成和衰老是十分復(fù)雜的生理生化過程，研究子實體形成和衰老機理，對于調(diào)節(jié)大型真菌子實體發(fā)育，具有重要理論和實踐意義。本研究以豬肚菇為研究材料，探究子實體形成和衰老過程中其細胞抗氧化酶活性和脂質(zhì)過氧化情況，為揭示其抗衰老機理提供理論依據(jù)，同時對理解子實體生理代謝規(guī)律具一定意義。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

供試菌株豬肚菇 LD-1 魯東大學(xué)食用菌工程技術(shù)研究中心。

葡萄糖、KH2PO4等試劑均為國產(chǎn)分析純；氮藍四唑(NBT)為進口分裝。

752N型紫外-可見分光光度計、冷凍離心機。

1.2 方法

1.2.1 子實體培養(yǎng)

將培養(yǎng)料按照配方(棉籽殼83%，麩皮15%，石灰2%，含水量63%)拌料、裝袋，滅菌、接種和培養(yǎng)，菌絲滿袋后移入栽培室采用袋內(nèi)覆土出菇，覆土厚度3～4cm。栽培室溫度在23～32℃，空氣相對濕度 90%～92%。待子實體形成后，分別采集不同發(fā)育階段的子實體樣品，采摘后的子實體放于冰盒中，立即帶回實驗室，用于生理指標(biāo)測定。

1.2.2 酶活性及MDA 含量的測定

超氧化物歧化酶(SOD)的活性以(NBT)光化還原法測定，以A560nm下抑制NBT還原的50%所需的酶量為SOD的一個酶活單位(U)，用U/g表示；過氧化氫酶(CAT)活性的測定采用紫外吸收法，過氧化物酶(POD)活性的測定采用愈創(chuàng)木酚法，在一級反應(yīng)范圍內(nèi)，分別以每分鐘內(nèi)A240和A470變化0.01為 CAT和POD的一個酶活單位(U)，用U/(mg·min)表示。

MDA含量測定：硫代巴比妥酸(TBA)比色法測定[8]。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2003和 SPSS13.0統(tǒng)計分析軟件進行數(shù)據(jù)分析及差異顯著性檢驗，所有數(shù)值均為3次重復(fù)平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬肚菇子實體不同發(fā)育階段形態(tài)的變化

豬肚菇子實體發(fā)育的各個階段形態(tài)差別較大，大致劃分為如圖1所示4個時期。圖1a為棒形期，此期為子實體發(fā)育的初級階段，即原基形成期，原基初期白色，球形或似卵形，后長成倒棒形。出土部分見光變灰色，逐步加深至鼠灰色或黑褐色。表面有灰白色鱗片。圖1b為釘頭期，此期為原基分化，菌蓋、菌柄、菌褶等器官形成期，棒形原基頂端細胞迅速增殖長成釘頭狀，縱切可見菌蓋、菌褶和碩長的菌柄。內(nèi)菌幕未破裂或剛破裂。圖1c為杯形期，此期菌蓋迅速發(fā)育，中部菌肉增厚，內(nèi)菌幕破裂，露出片狀菌褶。蓋頂平至下凹，顏色由蓋沿開始逐漸變淺。圖1d為成熟期，菌蓋完全伸展，菌肉變薄，顏色變淺，蓋緣平直至波曲，釋放出擔(dān)孢子。

圖1 豬肚菇子實體發(fā)育的4個時期Fig.1 Four stages of fruit body development for Panus giganteus

2.2 豬肚菇子實體不同發(fā)育階段SOD活性變化

圖2 豬肚菇子實體不同發(fā)育時期的SOD活性變化Fig.2 Change in SOD activity during fruit body development of Panus giganteus

如圖 2所示，豬肚菇子實體發(fā)育過程中，各個時期SOD活性達到顯著差異(P＜0.05)，其子實體中SOD活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，即由棒形期到杯形期發(fā)育期間，子實體中SOD逐漸增加，在杯形期 SOD活性達到最大，杯形期菌蓋 SOD活性是棒形期的 3.5倍，杯形期菌柄 SOD活性是棒狀期的 3.2倍。隨后 SOD活性開始降低，成熟期菌柄SOD活性明顯低于杯形期。

在杯形期和成熟期，菌蓋和菌柄的 SOD含量都達到差異顯著(P＜0.05)，菌蓋中 SOD含量顯著高于菌柄。菌蓋的生理代謝活動比菌柄更活躍，在研究大型真菌對于金屬離子的吸收和富集過程中也發(fā)現(xiàn)，富集的金屬離子在子實層中含量最高，其次是菌蓋部分，而菌柄中含量最低[9]。

SOD廣泛分布于細胞各組成部分，是防御自由基危害的第一道防線，催化O2-·或 HO·歧化為H2O2，一定程度上控制著活性氧(ROS)的含量，但其活性又受ROS的影響。對環(huán)境變化比較敏感。在豬肚菇子實體發(fā)育過程中，也表現(xiàn)出不同階段的明顯差異。

2.3 豬肚菇子實體不同發(fā)育階段POD 活性的變化

過氧化物酶(POD)是以過氧化氫為電子受體催化底物氧化的酶。主要存在于細胞的過氧化物酶體中，以鐵卟啉為輔基，可催化過氧化氫、氧化酚類和胺類化合物，具有消除過氧化氫和酚類、胺類毒性的雙重作用。如圖 3 所示，在豬肚菇子實體生長和衰老過程中，與SOD活性的變化趨勢不同，POD活性基本保持穩(wěn)定。

植物衰老過程中，其POD變化趨勢隨植物種類不同而不同。如荔枝、獼猴桃、胡柚等果實隨貯藏時間延長，POD活性增強，認為POD活性升高可以作為果實衰老的指標(biāo)；而杏果實成熟衰老過程中，POD活性則呈下降趨勢[10]。豬肚菇子實體生長和衰老過程中，無論菌柄還是菌蓋，其POD活性都基本保持穩(wěn)定，所以不宜作為子實體衰老的生理指標(biāo)。POD活性在子實體發(fā)育過程中保持基本穩(wěn)定屬于食用菌的普遍現(xiàn)象還是個例現(xiàn)象，需要進一步研究和探討。

圖3 豬肚菇子實體不同發(fā)育時期的POD活性變化Fig. 3 Change in POD activity during fruit body development of Panus giganteus

2.4 豬肚菇子實體不同發(fā)育階段CAT 活性的變化

CAT主要存在于過氧化物體，線粒體和乙醛酸循環(huán)體中，CAT是細胞內(nèi)H2O2的重要清除劑，但CAT清除H2O2的效率非常低，CAT活性顯著下降會造成H2O2積累。胞內(nèi)H2O2不能及時清除，可與過量的O2·生成氧化性更強的·OH。

從圖 4可以看出，CAT活性從棒形期到釘頭期迅速升高，然后逐漸降低。與SOD活性變化相比CAT活性高峰期的出現(xiàn)較早，在釘頭期達到最高。在杯形期和成熟期，菌蓋和菌柄之間的CAT酶活都達到差異顯著(P＜0.05)，在杯形期的CAT活性菌蓋高于菌柄，而在成熟期的CAT活性菌蓋低于菌柄。

圖4 豬肚菇子實體不同發(fā)育時期的CAT活性變化Fig.4 Change in CAT activity during fruit body development of Panus giganteus

2.5 豬肚菇子實體不同發(fā)育階段MDA含量的變化

膜的穩(wěn)定性是生物衰老過程中的重要生理指標(biāo)。膜脂過氧化加劇會導(dǎo)致膜脂不飽和度降低，膜流動性下降，對為膜所束縛的細胞酸性磷酸脂酶起明顯的增溶作用，膜脂分子構(gòu)象發(fā)生改變，致使細胞膜透性增強[11]。丙二醛(MDA)是細胞膜脂過氧化作用的主要產(chǎn)物之一，MDA在生物體內(nèi)的積累是活性氧毒害的表現(xiàn)，其含量是判斷膜脂過氧化程度的一個重要指標(biāo)。

由圖 5可知，隨著豬肚菇子實體的生長和衰老，子實體中MDA含量逐漸增加，到成熟期時，MDA含量明顯增加，其含量為棒形期的6.84倍，表明細胞膜膜脂過氧化程度加劇。所以MDA含量明顯增加，可以作為豬肚菇子實體衰老的主要指標(biāo)。

圖5 豬肚菇子實體不同發(fā)育時期的MDAs含量變化Fig.5 Change in MDA content during fruit body development of Panus giganteus

3 討 論

在正常情況下植物體內(nèi)有一套完整的活性氧清除系統(tǒng)(抗氧化酶和抗氧化劑)能將活性氧的產(chǎn)生和清除維持在動態(tài)平衡狀態(tài)。SOD是植物氧代謝過程中的一個極為重要的誘導(dǎo)酶，它能催化超氧陰離子自由基歧化反應(yīng)成為基態(tài)的分子氧和H2O2，并與 POD和 CAT組成活性氧防御酶系統(tǒng)[12-13]。抗氧化酶活性變化與子實體衰老密切相關(guān)。在衰老過程中活性氧大量產(chǎn)生，生物體可通過抗氧化保護酶系統(tǒng)中的 SOD、POD、CAT和 APX來調(diào)節(jié)活性氧產(chǎn)生與清除之間的平衡。

該實驗中，隨著子實體生長和衰老的進行，子實體中SOD活性開始增加，這可能是生物抗氧化衰老的一種防衛(wèi)響應(yīng)，隨著活性氧物質(zhì)的增加，防御系統(tǒng)進一步啟動，子實體中CAT活性進一步升高，起到協(xié)助清除活性氧物質(zhì)的作用。但是，隨著衰老的不可逆轉(zhuǎn)，整個防御系統(tǒng)遭到破壞，SOD、CAT的活性隨之降低，MDA含量迅速升高。但豬肚菇子實體生長和衰老進程中，POD活性則基本保持穩(wěn)定。因此，活性氧代謝失調(diào)引發(fā)的生物膜結(jié)構(gòu)破壞是豬肚菇子實體衰老的重要原因之一。

自由基引起的衰老理論在近半個多世紀(jì)以來得到了人們的廣泛關(guān)注，很多研究證實衰老過程中CAT、SOD、POD等抗氧化酶的活性均降低，導(dǎo)致自由基代謝產(chǎn)物增高，致使線粒體結(jié)構(gòu)的損傷，氧化呼吸傳遞鏈傳遞受阻，使自由基的生成量進一步增加，從而加速了衰老進程[14]。Orr等[15]將銅(Cu)鋅(Zn)超氧化物歧化酶和過氧化氫酶基因(sod與cat)導(dǎo)入果蠅，使其平均壽命和最高壽限都不同程度得到了延長，與之相關(guān)的與蛋白質(zhì)的氧化損傷現(xiàn)象減輕。從本實驗得知，在豬肚菇子實體生長階段，CAT和SOD活性維持在較高水平，活性氧自由基的水平亦較低；但在衰老階段，CAT和SOD活性明顯下降，致使自由基水平提高，并導(dǎo)致細胞膜損傷加劇。另外，CAT和SOD的活性隨豬肚菇子實體的發(fā)育階段的不同呈現(xiàn)明顯變化的特點，表明除MDA水平之外，CAT和SOD的活性也可以作為豬肚菇子實體的衰老標(biāo)記。因此，如果能利用合適的技術(shù)手段從生理水平上提高CAT和SOD的活性，將能延緩其衰老過程，延長豬肚菇的貨架期，這需要今后進一步深入研究。

[1]關(guān)軍鋒, 束懷瑞. 蘋果果實衰老與活性氧代謝的關(guān)系[J]. 園藝學(xué)報, 1996, 23(4): 326-328.

[2]RON M. Oxidative stress, antioxidants and stress tolerance[J]. Trends in Plant Science, 2002,7(9) : 405-410.

[3]趙天宏, 孫加偉, 付宇, 等. CO2和O3濃度升高對春小麥活性氧代謝及抗氧化酶活性的影響[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2009, 42(1): 64-71.

[4]任艷芳, 何俊瑜, 王思夢, 等. 臍橙花開放和衰老過程中抗氧化酶活性變化[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報, 2009, 25(19): 62-64.

[5]房偉民, 郭維明, 陳俊愉. 嫁接提高菊花耐高溫與抗氧化能力的研究[J]. 園藝學(xué)報, 2009, 36(9): 1327-1332.

[6]鄧旺秋, 李泰輝, 陳枝南, 等. 栽培食用菌豬肚菇的學(xué)名考證[J]. 食用菌學(xué)報, 2006, 13(3): 71-74.

[7]戴玉成, 周麗偉, 楊祝良, 等. 中國食用菌名錄[J]. 菌物學(xué)報, 2010, 29(2): 1-21.

[8]李玲. 植物生理學(xué)模塊實驗指導(dǎo)[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 2009: 1-173.

[9]PAVEL K, LUBOMIR S. A review of trace element concentrations in edible mushrooms[J]. Food Chemistry, 2000, 69: 273-281.

[10]吳彩娥, 寇曉紅, 王文生. 果實成熟衰老與保護酶系統(tǒng)的關(guān)系[J]. 中國果菜, 2002(6): 23-24.

[11]陳拓, 安黎哲, 馮虎元, 等. UV-B輻射對蠶豆膜脂過氧化的影響及其機制[J]. 生態(tài)學(xué)報, 2001, 21(4): 579-583.

[12]龍云, 鄧美玲, 談鋒. 絞股藍對水分脅迫的適應(yīng)性研究[J]. 西南師范大學(xué)學(xué)報: 自然科學(xué)版, 1999, 24(1): 81-86.

[13]NEILL S J, DESIKAN R, CLARKE A, et al. Hydrogen peroxide and nitric oxide as signaling molecules in plants[J]. Journal of Experimental Botany, 2002, 53: 1237-1247.

[14]MELOV S, RAVENSCROFT J, MALIK S, et al. Extension of life-span with superoxide dismutase/catalase mimetics[J]. Science, 2000, 289: 1567-1569.

[15]ORR W C, SOHAL R S. Extension of life-span by overexpression of superoxide dismutase and catalase in Drosophila melanogaster[J]. Science, 1994, 263: 1128-1130.

Change of Antioxidant Enzyme Activities in Fruit Body Development Process of Panus giganteus

DONG Hong-xin1,2，CHENG Xian-hao2，ZHU Lin2，CAI De-hua2，LI Yu1,*
(1. Institute of Mycology, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China；2. College of Life Science, Ludong University, Yantai 264025, China)

In this stady, the change in the content of malonaldehyde (MDA) and the activities of superoxide dismutase (SOD), peroxidase (POD) and catalase (CAT) in fruit body of Panus giganteus during its development process were investigated. Results indicated that MDA content exhibited a gradual accumulation and the membrane lipid peroxidation was increased; meanwhile, the activities of SOD and CAT exhibited an initial increase and a final decrease trend; the highest activity of SOD and CAT was observed in the cup stage and pin-head stage. However, POD activity was stable during the stage of growth and senescence. Therefore, the metabolic disorder induced by the accumulation of active oxygen species was one of important factors for the senescence of Panus giganteus.

Panus giganteus；fruiting body；development；antioxidant enzymes

S646.9

A

1002-6630(2010)24-0469-04

2010-03-24

“十一五”國家科技支撐計劃項目(2008BADA1B04)；山東省農(nóng)業(yè)良種工程項目(2008LZ-008)

董洪新(1976—)，男，講師，博士研究生，研究方向為食用菌栽培。E-mail：ytdhx@163.com

*通信作者：李玉(1944—)，男，教授，博士，研究方向為菌物學(xué)。E-mail：yuli966@126.com