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    云南栽培3種顏色瑪咖中總生物堿含量分析

    2010-03-24 09:05:39徐瓏峰陳曉鳴
    食品科學(xué) 2010年24期
    關(guān)鍵詞:咖的顯色劑比色法

    甘 瑾,馮 穎*,何 釗,徐瓏峰,張 弘,陳曉鳴

    (中國林業(yè)科學(xué)研究院資源昆蟲研究所,云南 昆明 650224)

    云南栽培3種顏色瑪咖中總生物堿含量分析

    甘 瑾,馮 穎*,何 釗,徐瓏峰,張 弘,陳曉鳴

    (中國林業(yè)科學(xué)研究院資源昆蟲研究所,云南 昆明 650224)

    建立云南栽培瑪咖的總生物堿含量的分析方法,分析評價3種色型瑪咖的總生物堿含量。分別采用酸性染料比色法和酸堿滴定法對云南栽培的3種色型瑪咖的總生物堿含量進(jìn)行測定。結(jié)果表明:酸性染料比色法靈敏度高,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差較小,是瑪咖總生物堿含量測定的適宜方法;紫色、白色和黃色3 種色型瑪咖的總生物堿含量分別為4.4078、2.9193、2.2241mg/g,差異達(dá)到極顯著水平(P<0.01);其中紫色瑪咖的總生物堿含量最高,并與相關(guān)文獻(xiàn)測定的來源于秘魯?shù)默斂Ц煞鄣目偵飰A含量相近。

    瑪咖;顏色;總生物堿;含量分析

    瑪咖(Lepidium meyenii Walp.)是生長在秘魯海拔4000~4500米的安第斯山脈的一種十字花科植物,在安第斯山脈地區(qū)瑪咖塊根作為藥食兼用的植物已有悠久的歷史,傳統(tǒng)用于提高性功能和生殖能力?,F(xiàn)代大量研究表明瑪咖具有抗疲勞、改善性功能、抗氧化、減少前列腺增生、緩解更年期綜合癥、抑制癌細(xì)胞、增加骨密度等多種功效[1]。國內(nèi)外專家對瑪咖的營養(yǎng)成分及次生代謝物質(zhì)進(jìn)行了較深入的研究,瑪咖不僅含有蛋白、氨基酸、脂肪及微量元素等營養(yǎng)成分[2],還含有多種次生代謝物質(zhì):瑪咖烯(macaene)、生物堿(包括瑪咖酰胺macamide)、芥子油苷及其水解衍生物、甾醇、多酚類及其他成分[3-5],這些次生代謝物質(zhì)被認(rèn)為與瑪咖的保健功效有密切關(guān)系[6-7]?,斂И?dú)特全面的功效已受到世界保健食品行業(yè)的廣泛關(guān)注。

    我國瑪咖栽培還未形成規(guī)模,瑪咖產(chǎn)品及原料均來源于國外,筆者所在項目組幾年前從秘魯引種栽培,已在云南種植成功,形成了一定的規(guī)模和產(chǎn)量,保存有3個不同色型的品種,并對引種栽培瑪咖的營養(yǎng)成分進(jìn)行了分析與評價,分析表明云南栽培瑪咖含有的營養(yǎng)成分與秘魯產(chǎn)瑪咖無本質(zhì)區(qū)別,可以作為食品資源開發(fā)利用[8];分析云南種植瑪咖乙醇提取物的體外抗氧化活性,研究結(jié)果表明云南種植的3種顏色瑪咖與原產(chǎn)秘魯?shù)默斂б粯泳哂锌寡趸钚訹9],說明在云南不同地區(qū)具有發(fā)展瑪咖種植產(chǎn)業(yè)的條件。

    生物堿是一類重要的天然有機(jī)化合物,廣泛地分布于植物界中,具有鎮(zhèn)痛、消炎、降壓、抗菌及抗癌等多種生理活性[10],生物堿也是瑪咖中重要的次生代謝物質(zhì)之一,Muhammad等[5]對瑪咖中的生物堿進(jìn)行了研究,在瑪咖干根的石油醚提取物中分離到兩種酰胺類生物堿,其中一種命名為“macaridine”。Cui等[11]從瑪咖根中分離出兩種咪唑生物堿,并稱它們具有選擇性對抗人類癌細(xì)胞的細(xì)胞毒素活性。2004年在瑪咖中又有5種新的酰胺類生物堿被分離鑒定[12]。McCollom等[13]對不同公司銷售的瑪咖產(chǎn)品中的瑪咖酰胺(macamides)進(jìn)行了定量分析,結(jié)果顯示瑪咖酰胺的含量范圍為0.0016%~0.0123%??偵飰A含量定量分析的常用方法有酸堿滴定法和分光光度法,依據(jù)不同的原料應(yīng)選擇與其相適應(yīng)的方法[14]。為了建立云南栽培瑪咖總生物堿的定量分析方法,分析不同顏色瑪咖總生物堿含量,本實驗分別采用比色法與滴定法對瑪咖總生物堿進(jìn)行測定比較,對云南栽培的3種色型瑪咖的總生物堿含量進(jìn)行分析評價,并與相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行對比,研究結(jié)果對云南瑪咖高產(chǎn)高質(zhì)栽培技術(shù)研究、功能活性成分的評價分析及云南栽培瑪咖更好地開發(fā)利提供參考依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    瑪咖:塊根顏色分別為紫色、黃色、白色的3種瑪咖原料均來源于中國林科院資源昆蟲研究所在云南省的引種栽培試驗地,收獲的瑪咖塊根清洗泥土后放入-5℃冰箱保存?zhèn)溆?,紫色、黃色、白色瑪咖含水率分別為52.00%、56.10%和55.2%。

    苦參堿對照品 中國藥品生物制品檢定所;甲醇、氯仿、無水乙醇等試劑均為分析純。

    1.2 儀器與設(shè)備

    DS-1型高速組織搗碎機(jī) 上海精科實業(yè)有限公司;AB204-S型電子分析天秤 瑞士梅特勒托利多儀器有限公司;N1000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 日本東京理化儀器有限公司;GL-20B型高速冷凍離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;DU800型紫外可見光分光光度計 美國貝克曼庫爾特有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1 瑪咖總生物堿提取液的制備

    將新鮮冷藏原料搗碎,取1g用甲醇20mL浸泡24h,過濾,取濾液為提取液。同法提取3次,合并提取液、濃縮為浸膏。然后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)2% HCl溶液洗滌溶解,共洗滌3次,合并酸液,5000r/min離心10mim。取酸溶液,用質(zhì)量分?jǐn)?shù)10% NaOH調(diào)至pH10,再用等體積氯仿萃取3次,合并萃取液、濃縮并定容至10mL。

    1.3.2 苦參堿對照品溶液的配制

    稱取苦參堿對照品10mg,精密稱定,溶于氯仿溶液中,并定容至100mL,得到質(zhì)量濃度為0.1mg/mL的對照品溶液。

    1.3.3 溴麝香草酚藍(lán)顯色劑配制

    稱取溴麝香草酚藍(lán)0.125g,精密稱定,溶于1000mL的一定pH值的磷酸緩沖溶液中,顯色劑濃度為2.0×10-4mol/L。緩沖溶液由0.2mol/L Na2HPO4·12H2O與0.2mol/L NaH2PO4·2H2O配制而成。

    1.3.4 酸性染料比色法實驗條件的確定

    1.3.4.1 酸性染料比色法最大吸收波長掃描

    取1.0mL氯仿溶液為空白,取黃色瑪咖總生物堿提取液0.5mL和對照品溶液0.5mL,加氯仿至1.0mL,分別在空白、對照和樣品溶液中加入2.0×10-4mol/L溴麝香草酚藍(lán)顯色劑6.0mL,氯仿5.0mL,密塞振搖2min,倒入分液漏斗中,靜置2h,取氯仿層4.0mL,在氯仿溶液中加入無水硫酸鈉(105℃干燥4h)0.2g,搖勻,放置10min,于300~700nm范圍內(nèi)掃描測定最大吸收波長。

    1.3.4.2 溴麝香草酚藍(lán)顯色劑pH值的確定

    取樣品溶液6份,每份1.0mL,分別加入pH值為6.8、7.0、7.2、7.4、7.6的2.0×10-4mol/L溴麝香草酚藍(lán)顯色劑6.0mL,氯仿5.0mL,密塞振搖2min,倒入分液漏斗中,靜置2h,取氯仿層4.0mL,在氯仿溶液中加入無水硫酸鈉0.2g,搖勻,放置10min,于最大吸收波長處測定吸光度。

    1.3.4.3 溴麝香草酚藍(lán)顯色劑用量的確定

    取樣品溶液7份,每份1.0mL,分別加入pH7.0的2.0×10-4mol/L溴麝香草酚藍(lán)顯色劑2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0mL,氯仿5.0mL,密塞振搖2min,倒入分液漏斗中,靜置2h,取氯仿層4.0mL,在氯仿層中分別加入無水硫酸鈉0.2g,搖勻,放置10min,于最大吸收波長處測定吸光度。

    1.3.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

    準(zhǔn)確吸取苦參堿對照品溶液0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mL,分別加入氯仿至1.0mL,再加入pH7.0的2.0×10-4mol/L溴麝香草酚藍(lán)顯色劑5.0mL,氯仿5.0mL,密塞振搖2min,倒入分液漏斗中,靜置2h,取氯仿層4.0mL,在氯仿層中分別加入無水硫酸鈉0.2g,搖勻,放置10min,以未加苦參堿的試驗樣為空白對照,于最大吸收波長處測定吸光度。以苦參堿對照品濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo),得出線性回歸方程。

    1.3.6 酸性染料比色法測定樣品生物堿含量

    每種顏色樣品取6份,每份1.0g,按照1.2.1節(jié)的方法進(jìn)行生物堿的提取,然后分別取樣品氯仿提取液,紫色、白色和黃色樣品生物堿氯仿提取液的取樣量分別為0.3、0.5、0.5mL,按照1.2.5節(jié)的方法進(jìn)行測定。根據(jù)回歸方程計算樣品生物堿含量,并計算RSD。

    1.3.7 酸堿滴定法測定樣品生物堿含量

    每種樣品取6份,每份1.0g,按照1.2.1節(jié)方法進(jìn)行生物堿的提取,所得氯仿提取液用60℃水浴蒸干。然后加入5.0mL無水乙醇溶解,加入0.01mol/L H2SO4溶液15mL,甲基紅指示液3滴,用0.02mol/L NaOH溶液滴定至黃色。讀取消耗的NaOH溶液的量,計算消耗H2SO4的量,并計算總生物堿的含量(每1mL H2SO4溶液(0.01mol/L)相當(dāng)于4.967mg的苦參堿)。

    1.3.8 數(shù)據(jù)處理

    實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 軟件(13.0 版)進(jìn)行方差分析的顯著性檢驗。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 酸性染料比色法測定條件的確定

    2.1.1 最大吸收波長確定

    圖1 樣品溴麝香草酚藍(lán)顯色后波長掃描Fig.1 UV-visible absorption spectrum of the sample

    圖2 對照品溴麝香草酚藍(lán)顯色后波長掃描Fig.2 UV-visible absorption spectrum of the standard sample

    掃描結(jié)果如圖1、2所示,樣品波長掃描曲線的最大峰值為414.0nm,對照品的最大峰值為411.5nm,樣品與對照品的最大峰略有差異,以樣品最大吸收波長為標(biāo)準(zhǔn),因此選擇414nm為測定波長。

    2.1.2 溴麝香草酚藍(lán)顯色劑pH值的確定

    從表1可看出,溴麝香草酚藍(lán)顯色劑pH7.0時,樣品的吸光度最大,表明pH7.0時顯色劑解離成的陰離子與瑪咖生物堿陽離子定量地結(jié)合成有色離子對。

    表1 不同pH值顯色劑對吸光度的影響Table 1 Effect of pH in dye on absorbance

    2.1.3 溴麝香草酚藍(lán)顯色劑用量的確定

    表2 顯色劑不同用量對吸光度的影響Table 2 Effect of color reagent in dye on absorbance

    表2顯示顯色劑用量為5.0mL時,樣品的吸光度最大,用量增加吸光度沒有繼續(xù)上升,表明5.0mL顯色劑形成的陰離子足夠與樣品的生物堿陽離子定量地結(jié)合成有色離子對,使樣品充分顯色。

    根據(jù)以上實驗結(jié)果,確定酸性染料比色法的測定條件:檢測波長414nm,溴麝香草酚藍(lán)顯色劑pH7.0,顯色劑用量為5.0mL。

    2.2 線性范圍

    標(biāo)準(zhǔn)曲線制作結(jié)果,得到回歸方程為A=11.229C-0.0049,線性關(guān)系R2=0.9951,苦參堿在0.01~0.06mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

    2.3 瑪咖總生物堿含量比色法與滴定法測定結(jié)果的比較

    采用酸性染料比色法和酸堿滴定法分別對3種顏色瑪咖的總生物堿含量進(jìn)行測定,結(jié)果見表3。

    表3 3種顏色瑪咖總生物堿含量測定結(jié)果Table 3 Contents of total alkaloids in 3 color types of Maca

    從表3可以看出,酸性染料比色法測定結(jié)果3種顏色瑪咖的總生物堿含量為2.2241~4.4078mg/g,而滴定法測定結(jié)果為5.8025~6.6401mg/g,兩種方法的測定結(jié)果差異較大,依據(jù)不同品種滴定法測定結(jié)果是比色法的1.43~2.98倍。滴定法是基于生物堿的堿性與酸反應(yīng),根據(jù)酸消耗量計算含量,而堿性的強(qiáng)弱與氮原子的雜化度、誘導(dǎo)效應(yīng)、共軛效應(yīng)、空間效應(yīng)及分子內(nèi)氫鍵形成等有關(guān)。比色法是生物堿在緩沖溶液中結(jié)合成的陽離子與酸性染料解離成的陰離子定量結(jié)合為有色離子對而顯色[10],結(jié)果差異就是由于這兩種方法的反應(yīng)原理不同而導(dǎo)致的。比色法的RSD為0.75%~1.92%,而滴定法的RSD為1.81%~5.68%,滴定法的RSD明顯高于比色法,而且已超出允許的范圍[14]。滴定法中滴定終點(diǎn)是溶液由橘紅色變?yōu)辄S色,瑪咖生物堿的滴定終點(diǎn)突變不是很明顯,重現(xiàn)性不好,滴定液誤差很難避免,而滴定液很微小的誤差都會造成計算結(jié)果的很大差異。從實驗結(jié)果可知,滴定法所需的原料量較大,測定結(jié)果誤差大。而比色法誤差小,所需原料量較小,對總生物堿含量較低的原料也有較高的靈敏度。通過對比色法和滴定法結(jié)果的比較,認(rèn)為對于瑪咖總生物堿含量的測定,酸性染料比色法是較理想的方法。

    2.4 不同顏色瑪咖總生物堿含量的比較

    比色法測定結(jié)果顯示(表3),3種顏色的瑪咖中,紫色瑪咖的總生物堿含量最高,達(dá)到4.408mg/g,其次是白色樣品,黃色樣品的總生物堿含量較低,通過方差分析顯著性檢驗,3個樣品總生物堿含量的差異已達(dá)到極顯著水平(P<0.01)。滴定法測定結(jié)果顯示(表3),黃色瑪咖的總生物堿含量最高,白色最低,白色瑪咖與紫色、黃色瑪咖總生物堿含量的差異達(dá)到極顯著水平(P<0.01),而紫色與黃色之間的總生物堿含量在此水平上差異沒有達(dá)到顯著水平。滴定法中紫色樣品與白色樣品測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)較大,表明這兩種原料總生物堿含量的測定結(jié)果有很大誤差,不能準(zhǔn)確反映樣品的真實含量,因此樣品含量的差異與比色法結(jié)果不一致。以比色法測定結(jié)果為依據(jù),表明云南栽培的紫色、黃色和白色3種瑪咖中的總生物堿含量具有極顯著的差異,其中紫色瑪咖的總生物堿含量最高,為4.4078mg/g。

    3 結(jié)論與討論

    通過對瑪咖總生物堿含量比色法與滴定法測定結(jié)果的比較,確定酸性染料比色法是測定瑪咖總生物堿含量較理想的方法;通過對酸性染料比色法測定的條件考察,確定了比色測定的方法與條件:測定波長為414nm,溴麝香草酚藍(lán)顯色劑的pH7.0,用量為5.0mL。比色法和酸堿滴定法是測定總生物堿含量的常用方法,而對于不同原料,應(yīng)根據(jù)測定結(jié)果的準(zhǔn)確性、誤差、靈敏度等因素來選擇較為適宜的方法。在附子總生物堿含量的測定中,何軍等[15]通過對兩種方法測定結(jié)果的比較,認(rèn)為滴定法操作簡單,穩(wěn)定性較好,較為適宜。張超等[16]采用兩種方法測定了山豆根中總生物堿含量,試驗結(jié)果表明兩種方法各有優(yōu)點(diǎn),均可用于總生物堿的測定。酸性染料比色法因重復(fù)性好、靈敏度高、準(zhǔn)確可靠,在許多原料的生物堿含量檢測中被廣泛應(yīng)用[17-19]。本實驗通過對兩種方法測定結(jié)果的比較,發(fā)現(xiàn)采用滴定法測定瑪咖總生物堿時,滴定終點(diǎn)不明顯,重現(xiàn)性較差,結(jié)果誤差較大,筆者認(rèn)為這與瑪咖總生物堿含量不高、滴定法靈敏度較低等因素有關(guān),因此瑪咖總生物堿含量測定宜采用靈敏度較高的比色法。

    從比色法的測定結(jié)果可看出3種顏色瑪咖的總生物堿含量的差異達(dá)到了極顯著水平(P<0.01),其中紫色瑪咖的總生物堿含量最大,是另外兩種樣品的1.51~1.98倍。金文聞[20]對瑪咖干粉(秘魯生產(chǎn),顏色品種不詳)的總生物堿進(jìn)行測定,比色法測定含量為0.4316%,本實驗測定的云南栽培的紫色瑪咖的總生物堿含量與此相近。

    目前還沒看到對不同顏色瑪咖的次生代謝物質(zhì),特別是對不同顏色瑪咖的生物堿含量進(jìn)行分析研究的文獻(xiàn)報道,但對不同顏色瑪咖的生物功能的比較已有研究。Gonzales等[21-22]和Rubio等[23]用不同顏色的瑪咖對抑制大鼠前列腺增生、促進(jìn)大鼠精子發(fā)生、提高切除卵巢小鼠的認(rèn)知能力和抗壓能力等生物功能進(jìn)行了研究,結(jié)果表明不同顏色瑪咖的生物活性有明顯的差異。云南種植瑪咖的體外抗氧化活性分析表明,對于不同的抗氧化體系,3種顏色瑪咖抗氧化能力存在一定差別[9]。這些研究表明不同顏色瑪咖的生物功能存在明顯差異,由此可推測不同顏色瑪咖的生物活性物質(zhì)含量也一定有較大差別,本實驗對不同顏色瑪咖總生物堿的測定結(jié)果也進(jìn)一步說明了此推測。關(guān)于生物堿與瑪咖生物活性功能的關(guān)系以及活性功能差異與生物堿等次生代謝物質(zhì)的含量是否有關(guān)還有待進(jìn)一步深入的研究。

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    Total Alkaloids in Maca (Lepidium meyenii) Cultivated in Yunnan

    GAN Jin,F(xiàn)ENG Ying*,HE Zhao,XU Long-feng,ZHANG Hong,CHEN Xiao-ming
    (Research Institute of Resources Insect, Chinese Academy of Forestry, Kunming 650224, China)

    In this syudy, a determination method was established to analyze the contents of total alkaloids in Maca (Lepidium meyenii) cultivated in Yunnan with 3 kinds of different color. Total alkaloids in 3 color types of Maca were analyzed by acidic dye colorimetry and titration, respectively. Results indicated that acidic dye colorimetry was sensitive with less relative standard deviation (RSD). This method is more appropriate for the determination of total alkaloids in Maca cultivated in Yunnan; The contents of total alkaloids in purple Maca, white Maca and yellow Maca cultivated in Yunnan were 4.4078, 2.9193 and 2.2241 mg/g, respectively, with a significant difference (P< 0.01). The content of total alkaloids in purple Maca is the highest, which is close to the content of total alkaloids in Maca grown in Peru.

    Maca (Lepidium meyenii);color type;total alkaloids;content analysis

    Q946.88;TS218

    A

    1002-6630(2010)24-0415-05

    2010-09-21

    國家林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(201004028);國家林業(yè)局“948”項目(2008-4-13)

    甘瑾(1967—),女,副研究員,博士研究生,研究方向為天然產(chǎn)物活性物質(zhì)。E-mail:ganjin638@126.com

    *通信作者:馮穎(1960—),女,研究員,博士,研究方向為藥用昆蟲和天然產(chǎn)物。E-mail:yingf@hotmail.com

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