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    低聚糖阿魏酸酯含量的快速測定方法

    2010-03-23 08:43:36趙陽陽歐仕益林奇齡林海偉
    食品科學 2010年18期
    關鍵詞:低聚糖玉米芯麥麩

    趙陽陽,歐仕益,*,林奇齡,2,林海偉

    (1.暨南大學食品科學與工程系,廣東 廣州 510632;2.華南理工大學輕工與食品學院,廣東 廣州 510641)

    低聚糖阿魏酸酯含量的快速測定方法

    趙陽陽1,歐仕益1,*,林奇齡1,2,林海偉1

    (1.暨南大學食品科學與工程系,廣東 廣州 510632;2.華南理工大學輕工與食品學院,廣東 廣州 510641)

    分別以麥麩、玉米芯、玉米麩皮為原料,采用酶法制備低聚糖阿魏酸酯,探討其快速檢測方法,并通過高效液相色譜法驗證該法的準確性。結果表明,采用Amberlite樹脂分離純化可除去樣品中的低聚糖(不含結合態(tài)的阿魏酸)、雙波長分光光度法(345nm和375nm)結合還原糖法可用于對低聚糖阿魏酸酯進行準確定量。

    低聚糖阿魏酸酯;阿魏酸;測定;雙波長分光光度法;高效液相色譜法

    阿魏酸(ferulic acid,F(xiàn)A),化學名稱為3-甲氧基-4-羥基肉桂酸,是植物界普遍存在的一種酚酸。阿魏酸是公認的天然安全的自由基淬滅劑和抗氧化劑,對過氧化氫、羥自由基、超氧陰離子自由基、過氧化亞硝基都有強烈的清除作用[1-2]。Prasad等[3]研究表明,阿魏酸能有效降低紫外輻射對人體淋巴細胞的氧化程度。阿魏酸在植物中主要通過酯鍵與細胞壁多糖和木質(zhì)素交聯(lián),或自身酯化或醚化形成雙阿魏酸,從而構成細胞壁的一部分[4],其含量為0.4%~3.6%,因原料來源而異[5-8]。

    低聚糖阿魏酸酯(feruloylated oligosaccharides,F(xiàn)Os)是指低聚糖中不同位置上的糖羥基與阿魏酸羧基酯化形成的一類化合物,可采用酶法或酸法水解麩皮、秸稈獲得[9-12]。近年來,國內(nèi)外在低聚糖阿魏酸酯的制備、功能研究領域有大量的報道。研究表明,低聚糖阿魏酸酯的抗氧化能力顯著高于游離阿魏酸和VC[13-16],能增加體內(nèi)抗氧化酶活性并具有良好的益生菌增殖活性[12,17-18]。但是,由于纖維質(zhì)水解的隨機性,水解后獲得的產(chǎn)物低聚糖的聚合度存在不均一性,加上不同原料阿魏酸含量差異,造成不同來源的低聚糖阿魏酸酯結合的阿魏酸含量存在顯著差別,給低聚糖阿魏酸酯的檢測增加了難度,因此,建立快速、準確的低聚糖阿魏酸酯檢測方法十分必要。

    本研究首先對酶解產(chǎn)物進行分離純化,獲得純度較高的低聚糖阿魏酸酯,探討了雙波長分光光度法測定低聚糖阿魏酸酯的方法,并與高效液相色譜法進行對比分析,以期為低聚糖阿魏酸酯含量提供快速便捷的定量檢測方法。

    1 材料與方法

    1.1材料與試劑

    小麥麩皮 南方面粉廠;玉米芯購自山東農(nóng)村;玉米麩皮 石家莊市大地飼料有限公司。

    戊聚糖酶、Viscozyme L酶液 諾維信公司;精制木瓜蛋白酶 遠天酶制劑公司;耐高溫α-淀粉酶 廣州裕立寶生物科技有限公司;阿魏酸標準品 Sigma公司;甲醇、冰乙酸(均為色譜純);其他試劑均為分析純。

    1.2 儀器與設備

    HH-4恒溫水浴鍋 江蘇金壇市宏體儀器廠;TGL-16G-A冷凍離心機 上海安汀科學儀器廠;SHA-BA恒溫振蕩器 江蘇省金壇市神科儀器廠;UV-9600紫外-可見分光光度計 北京瑞利分析儀器公司;RE-52C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;LC-20AT高效液相色譜分析系統(tǒng) 日本島津公司。

    1.3 方法

    1.3.1 原料預處理

    按薛楓等[19]的方法進行原料預處理。將粉碎過篩(60目)的玉米麩皮、麥麩、玉米芯在105℃條件下干燥4h,用淀粉酶、木瓜蛋白酶去除其中的淀粉和蛋白質(zhì),過濾,殘渣水洗、烘干,制得去淀粉去蛋白原料備用。

    1.3.2 低聚糖阿魏酸酯的制備

    按Yuan等[12]的方法進行。

    將2g木聚糖酶粉和1g Viscozyme L酶液分別溶于pH4.5的鹽酸溶液,定容至1000mL,獲得0.3g/100mL混合酶液。分別稱取10g預處理后的麥麩、玉米芯、玉米麩皮,用200mL的0.3g/100mL混合酶液于50℃恒溫振蕩器中酶解6h。酶解后,沸水中加熱滅酶10min,離心(4000r/min,20min),經(jīng)布濾并洗濾渣,合并濾液定容到200mL,獲得粗低聚糖阿魏酸酯溶液。

    1.3.3Amberlite樹脂分離純化阿魏酸酯及糖、酯含量測定

    經(jīng)預處理(醇泡、水洗至無醇味)的Amberlite樹脂備用裝柱(濕法上柱),分別取適量粗低聚糖阿魏酸酯溶液樣品上樣,解吸方法為先以純水除去雜質(zhì),再以一定體積分數(shù)的乙醇溶液解吸,收集解吸液,測定其中的阿魏酸、糖含量。

    Amberlite樹脂分離純化條件:上樣量:30mL;玻璃層析柱:10mm×280mm;樹脂量:10mL;流速:0.5mL/min;水洗量:60mL;解吸液(體積分數(shù)60%的乙醇溶液):50mL。

    1.3.4 雙波長分光光度法測定低聚糖阿魏酸酯的含量[11]

    取適當稀釋的低聚糖阿魏酸酯酶解液0.1mL,與0.9mL的0.1mol/L硼砂-甘氨酸緩沖溶液(pH10)混合,在345nm和375nm波長處測定混合溶液的吸光度。根據(jù)阿魏酸的摩爾吸光系數(shù)(M-1cm-1):=19662、=7630和低聚糖阿魏酸酯摩爾吸光系數(shù)(M-1cm-1):ε345=23064、ε375=31430計算低聚糖阿魏酸酯中阿魏酸的物質(zhì)的量濃度。

    式中:C1為游離阿魏酸濃度/(mol/L); C2為低聚糖阿魏酸酯中的阿魏酸濃度/(mol/L);b為比色皿厚度/ cm;A345為波長345nm的OD值;A375為波長375nm的OD值。

    1.3.5 糖含量測定

    以105℃干燥至質(zhì)量恒定的無水木糖為標準品制作標準曲線,得回歸方程y=0.751x-0.0112,R2=0.9997。

    還原糖含量的測定:采用3,5-二硝基水楊酸(DNS)法[20](以木糖計,g/L)。

    可溶性總糖含量的測定:取10mL粗低聚糖阿魏酸酯溶液于100mL三角瓶中加入10mL 6mol/L HCl溶液及15mL蒸餾水,沸水浴加熱水解30min,冷卻后以6mol/ L NaOH溶液中和,移至100mL容量瓶中定容,稀釋適當倍數(shù)[21]按DNS法測定。

    平均聚合度(DP)=可溶性總糖含量/還原糖含量。各處理重復3次。

    1.3.6HPLC法測定低聚糖阿魏酸酯的含量[22]

    取粗低聚糖阿魏酸酯濃縮液(10mL)用NaOH溶液(10mL,2.0 mol/L )于35℃暗處堿解60min,取出冷卻后,加HCl溶液(5mL,2.0mol/L)調(diào)至近中性。同時用HPLC法直接測定堿解液中游離阿魏酸含量。色譜分析條件:色譜柱:Eclipse XDB-C18(4.6mm×250mm,5μm);流動相:體積分數(shù)1%醋酸溶液-甲醇(72:28,V/V);檢測波長:313nm;流速:1mL/min;柱溫:40℃;進樣量10μL;以保留時間定性,面積歸一法計算相對含量。

    阿魏酸標準品回歸方程的制作:分別配制25、50、75、100、125μg/mL的阿魏酸標準品乙醇溶液,得峰面積y與質(zhì)量濃度x的線性回歸方程為y=45919x+27805,R2=0.9995。

    2 結果與分析

    2.1 雙波長分光光度法測定粗低聚糖阿魏酸酯溶液中的阿魏酸含量

    Amberlite樹脂吸附低聚糖阿魏酸酯而不吸附低聚糖,從而實現(xiàn)低聚糖阿魏酸酯的分離純化[12]。

    本研究采用Amberlite樹脂分離純化粗低聚糖阿魏酸酯,并用雙波長分光光度法測定低聚糖阿魏酸酯中的阿魏酸含量,結果如表1所示。由表1可以看出,采用

    Amberlite樹脂分離純化后,純化物中還原糖和總糖含量都顯著降低,平均聚合度大大增加,說明Amberlite樹脂可有效除去酶解液中的游離低聚糖和單糖。

    為驗證雙波長分光光度法測定低聚糖阿魏酸酯中的阿魏酸含量(表2)的準確性,本研究先采用HPLC法測定低聚糖阿魏酸酯中的游離阿魏酸,而后將低聚糖阿魏酸酯堿解使結合態(tài)的阿魏酸游離出來,采用HPLC法測定總阿魏酸含量,結果如表3所示。

    表1 麥麩、玉米芯和玉米麩皮酶解液采用Amberlite樹脂分離前后的還原糖、總糖和平均聚合度的變化Table 1 Contents of reducing sugars and total soluble sugars and average degrees of polymerization of enzymatic hydrolysates from wheat bran, corn cob and corn bran before and after Amberlite resin separation

    表2 麥麩、玉米芯和玉米麩皮酶解液中的阿魏酸含量和經(jīng)Amberlite樹脂吸附后的解吸液中阿魏酸含量Table 2 Determination of ferulic acid in enzymatic hydrolysates from wheat bran, corn cob and corn bran and their Amberlite resin purification products by DW spectrophotometry

    表3 麥麩、玉米芯和玉米麩皮酶解液及經(jīng)Amberlite樹脂吸附后的解吸液堿處理前后HPLC測定的阿魏酸含量Table 3 Determination of ferulic acid in enzymatic hydrolysates from wheat bran, corn cob and corn bran and their pre- and post-alkalosis Amberlite resin purification products by HPLC method

    比較表2、3可以看出,雙波長分光光度法測定的游離阿魏酸含量與HPLC法差別較大,表明本法不適合測定游離阿魏酸含量;但用于測定麥麩、玉米芯、玉米麩皮樣液中阿魏酸酯中結合態(tài)阿魏酸的含量時,其相對誤差分別為6.72%、0.23%、9.69%,相對標準偏差(RSD)分別為4.92%、0.16%、7.2%,即與HPLC法基本一致,說明本法用于測定低聚糖阿魏酸酯中阿魏酸含量是可行的,即本實驗建立的分析方法準確可靠。

    與單獨測定各待測液相比較,分別取上述待測液按表4等比例混合,按上述含量測定方法分別測定游離阿魏酸和粗低聚糖阿魏酸酯溶液中阿魏酸含量,其RSD分別為4.15%、5.25%、4.89%、6.95%和1.46%、3.55%、1.61%、4.74%,說明該法測定的重復性及穩(wěn)定性較好。

    表4 麥麩、玉米芯和玉米麩皮酶解液中的阿魏酸含量和經(jīng)Amberlite樹脂吸附后的混合解吸液中阿魏酸含量Table 4 Determination of ferulic acid in mixed enzymatic hydrolysates from wheat bran, corn cob and corn bran and mixtures of their Amberlite resin purification products by DW spectrophotometry

    2.2HPLC直接檢測低聚糖阿魏酸酯的含量

    圖1 阿魏酸標準樣品(A)、麥麩和玉米芯低聚糖阿魏酸酯(B、C)及其堿解液(D、E)的HPLC圖譜Fig.1 HPLC chromatogram of ferulic acid standard (A), feruloylated oligosaccharides prepared from wheat bran and corn cob (B and C) and their alkaline hydrolysates (D and E)

    圖1 比較了低聚糖阿魏酸酯及其堿解液的HPLC圖譜??梢钥闯觯甥滬熀陀衩仔局苽涞拇值途厶前⑽核狨ト芤涸趬A解前都出現(xiàn)了許多色譜峰,但堿解后麥麩只出現(xiàn)了阿魏酸的色譜峰,玉米芯分別只出現(xiàn)了阿魏酸和香豆酸的色譜峰。由于糖類沒有紫外吸收,因此麥麩和玉米芯低聚糖阿魏酸酯的色譜峰都為低聚糖阿魏酸酯,說明酶解后制備出的低聚糖阿魏酸酯成分復雜,難以獲得標準樣品采用HPLC進行定量檢測,故體現(xiàn)了該法檢測的必要性。

    3 結 論

    本研究采用Amberlite樹脂可純化低聚糖阿魏酸酯,通過雙波長分光光度法(345nm和375nm)可準確測定結合在低聚糖阿魏酸酯上的阿魏酸含量,實現(xiàn)對低聚糖阿魏酸酯的表征。結合在低聚糖阿魏酸酯上的阿魏酸含量,通過高效液相色譜法對雙波長分光光度法進行準確度驗證,其RSD分別為4.92%、0.16%、7.2%,說明具有較好的準確性;且通過對混合樣品的檢測,其RSD分別為1.46%、3.55%、1.61%、4.74%,說明具有較好的穩(wěn)定性和重復性。

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    Rapid Determination of Feruloylated Oligosaccharides during Production

    ZHAO Yang-yang1,OU Shi-yi1,*,LIN Qi-ling1,2,LIN Hai-wei1
    (1. Department of Food Science and Engineering, Jinan University, Guangzhou 510632, China;2. College of Light Industry and Food Sciences, South China University of Technology, Guangzhou 510641, China)

    In this work, feruloylated oligosaccharides were prepared from each of three raw materials, namely, wheat bran, corn cob and corn bran, by enzymatic hydrolysis. A rapid method for determining feruloylated oligosaccharides was developed and verified by high performance liquid chromatography. Non-feruloylated oligosaccharides were removed by Amberlite resin chromatography, and the purified feruloylated oligosaccharide could be determined by using dual wavelength (DW) spectrophotometry (345 nm and 375 nm) coupled with the determination of reducing sugars after acidolysis.

    feruloylated oligosaccharides;ferulic acid;determination;dual wavelength spectrophotometry;highperformance liquid chromatography

    TS207.3

    A

    1002-6630(2010)18-0329-04

    2010-06-07

    廣東高校科技成果產(chǎn)業(yè)化重大項目(cgzhzd0709)

    趙陽陽(1987—),女,碩士研究生,研究方向為功能食品。E-mail:zhaoyangyangcg@126.com

    *通信作者:歐仕益(1963—),男,教授,博士,研究方向為食品化學及功能食品。E-mail:tosy@jnu.edu.cn

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