響應面分析法優(yōu)化普通茶籽中抗氧化物質的水提工藝

李起弘，鄭鐵松*，王華清

(南京師范大學金陵女子學院食品科學與營養(yǎng)系，江蘇 南京 210097)

響應面分析法優(yōu)化普通茶籽中抗氧化物質的水提工藝

李起弘，鄭鐵松*，王華清

(南京師范大學金陵女子學院食品科學與營養(yǎng)系，江蘇 南京 210097)

以普通茶籽為研究對象，用還原能力來表示茶籽水提物的抗氧化能力。在單因素試驗基礎上，選取液料比、提取時間、提取溫度為自變量，還原能力(吸光度)為響應值，利用Box-Benhnken中心組合設計原理和響應面分析法，研究各自變量及其交互作用對還原能力的影響，模擬得到二次多項式回歸方程的預測模型，并確定最佳提取條件為液料比16:1(mL/g)、提取時間1.6h、提取溫度81℃。在此條件下，還原能力(吸光度)為0.616± 0.005，與預測值0.610較為一致。

普通茶籽；抗氧化；還原能力；響應面分析法

茶籽是茶樹的種子，常見的有兩種，一種是茶葉(Camellia sinensis)茶籽，另一種是油茶(Camellia oleifia)茶籽[1]，后者的葉子不能制茶，主要用途是取茶籽榨油[2]。國內外對油茶進行了較多研究[3-6]，但是關于普通茶籽的研究還鮮見報道。眾所周知，我國是一個茶葉大國，茶樹的種植幾乎遍及全國。據報道，我國茶樹種子的年產量可達70萬噸。成熟的茶籽除繁殖茶樹外，其余大部分自然脫落，在地里腐爛，造成了資源的浪費[7]。況且，隨著無性繁殖的推廣，普通茶籽更是成了無人問津的“廢棄物”。

常用的物質抗氧化能力檢測方法主要基于4種[8-9]，其中一種就是測定還原能力的方法。還原能力的測定，可檢驗待測物是否為良好的電子供體，待測物所提供的電子可以使Fe3+還原為Fe2+，使體系溶液顏色改變，加入待測物后，在700nm波長處根據其吸光度的變化可以得知Fe3+含量的變化[10]。待測物的還原性與吸光度大小有關，吸光度越大還原性越強。在一般情況下，物質的還原能力與抗氧化能力呈正相關[11-13]，因此還原能力已被廣泛應用于多糖[14]、黃酮[15]、阿魏酸[16]等多種功能性物質的體外抗氧化能力評價。

響應面分析法是一種優(yōu)化反應條件和加工工藝參數的有效方法[17]，近年來被廣泛應用于眾多過程的優(yōu)化控制[18-20]，如化學化工、生物工程、食品工業(yè)等方面[21-24]。它與正交試驗設計法不同，具有試驗周期短，求得的回歸方程精度高，能研究幾種因素間交互作用等優(yōu)點[25]。本研究在單因素試驗基礎上，通過響應面分析法對普通茶籽水提取物的還原能力進行工藝參數優(yōu)化，確定最佳提取工藝，為普通茶籽的開發(fā)利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

普通茶籽粉(諸葉種，剝去青苞、外殼，曬干磨粉，過40目篩后儲存?zhèn)溆? 溧水縣明覺鎮(zhèn)茶廠；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、鐵氰化鉀、三氯乙酸、高氯化鐵(均為國產分析純)。

1.2 儀器與設備

AM3250B微型旋渦混合儀 上海滬西分析儀器有限公司；HH-6數顯恒溫水浴鍋 金壇市富華儀器有限公司；722型可見分光光度計 上海精密科學儀器有限公司；LD5-10低速離心機 北京醫(yī)用離心機廠。

1.3 方法

1.3.1 還原能力的測定

參照Oyaizu[26]的方法進行測定。還原能力的強弱以波長700nm處的吸光度值表示。

1.3.2 單因素試驗

準確稱取10.0000g普通茶籽粉，置于250mL圓底燒瓶中，在水浴鍋中以蒸餾水浸提，提取物過濾，取上清液測定還原能力，以確定提取因素變化范圍以及各因素的適宜值。

1.3.3 提取條件優(yōu)化方案

在單因素試驗基礎上，選取影響較大的因素，根據Box-Benhnken中心組合試驗設計原理[27]，用Design Expert7.0軟件進行響應面優(yōu)化分析[28]。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 液料比對普通茶籽還原能力的影響

在溫度80℃，提取時間2h的條件下，以液料比5:1、10:1、15:1、20:1、25:1(mL/g)進行試驗，不同液料比對還原能力的影響見圖1。

由圖1可知，隨著液料比的逐漸增大，還原能力先增大后減小。一般說來，液料比越高提取率也越高。但是液料比增加，會造成溶劑和能源的浪費，給后來的蒸發(fā)工序增加困難，而且成本增加。在保證提取效果的同時，應盡量減少水的用量和降低蒸發(fā)濃縮負荷[29]。并且當液料比大到一定程度時，溶劑對有效成分的浸出達到平衡狀態(tài)。再增大液料比，雜質成分會競爭溶出而不利于有效成分的提取[30]。綜合考慮，液料比以控制在15:1(mL/g)為宜。

圖1 液料比對還原能力的影響(n=3)Fig.1 Effect of liquid/material ratio on 700 nm absorbance of reducing power (n = 3)

2.1.2 提取時間對普通茶籽還原能力的影響

在溫度80℃、液料比10:1(mL/g)的條件下，以提取時間0.5、1、1.5、2、2.5h進行試驗，不同提取時間對還原能力的影響見圖2。

圖2 提取時間對還原能力的影響(n=3)Fig.2 Effect of length of extraction time on 700 nm absorbance of reducing power (n = 3)

由圖2可知，隨著時間延長，還原能力逐漸增加，在1.5h前增加較明顯，說明時間越短提取越不充分，在1.5h之后還原能力基本保持平緩，說明茶籽中水溶性抗氧化物質已基本提取完畢，為縮短工時、節(jié)省能源，所以選取最佳提取時間1.5h。

2.1.3 提取溫度對普通茶籽還原能力的影響

在液料比10:1(mL/g)，提取時間0.5h條件下，以提取溫度60、70、80、90、100℃進行試驗，不同提取溫度對還原能力的影響見圖3。

由圖3可知，隨溫度的逐漸升高，還原能力不斷增加，在80℃前增加較為明顯，原因可能是溫度升高，分子熱運動逐漸加快，水溶性抗氧化物質的溶出速度逐漸加快[30]。溫度在80～90℃時，還原能力無顯著差異，高于90℃時，又呈增大趨勢。但從實際提取過程中發(fā)現，高于90℃時，提取液表面會有油性物質生成，此時的抗氧化成分不是純粹水溶性的，可能含有油溶性的

抗氧化性物質，會造成試驗誤差，影響試驗結果，不宜采用。綜合考慮，提取溫度在80℃為宜。

圖3 提取溫度對還原能力的影響(n=3)Fig.3 Effect of extraction temperature on 700 nm absorbance of reducing power (n = 3)

2.2 響應面法提取條件的優(yōu)化

2.2.1 響應面試驗設計及結果

根據Box-Benhnken中心組合試驗設計原理，綜合單因素試驗結果，選取液料比、提取時間、提取溫度3個因素，在單因素試驗的基礎上采用三因素三水平的響應面分析方法進行試驗設計，各試驗組的編碼與取值見表1，試驗設計及結果見表2。

表1 響應面試驗因素水平編碼表Table 1 Variables and levels in the three-variable, three-level Box-Behnken experimental design

表2 Box-Behnken試驗設計及結果Table 2 Arrangement and results of the three- variable, three-level Box-Behnken experimental design

使用Design Expert 7.0軟件，以液料比、提取時間、提取溫度為響應變量，以普通茶籽提取物的還原能力(吸光度)為響應值(指標值)對表2的數據進行處理，得到表3回歸方程方差分析表，利用軟件進行非線性回歸的二次多項式擬合，得到預測模型如下：

Y=0.60＋0.064A＋0.021B＋0.018C－0.020AB＋0.005AC－0.012BC－0.12A2－0.057B2－0.066C2

表3 回歸方程方差分析表Table 3 Analysis of variances for the developed regression equation

由表3可以看出，該模型效應極顯著(P＜0.0001)，各因素中一次項A(液料比)、二次項A(液料比)、二次項B(時間)、二次項C(溫度)、交互項AB都是極顯著的，其次一次項B(時間)、一次項C(溫度)和交互項BC顯著，交互項AC不顯著。由此可見，各具體試驗因素對響應值的影響不是簡單的線性關系。R2=0.9953，說明該回歸方程回歸效果比較好；R2Adj=0.9893，說明可信度高；失擬項不顯著，說明回歸方程擬合程度良好。

根據回歸方程，做出響應面分析圖(圖4～6)，考察所擬合的響應曲面的形狀，分析液料比、提取時間、提取溫度對普通茶籽提取物還原能力的影響。

2.2.2 液料比和提取時間的交互影響

圖4 液料比和提取時間對還原能力影響的等高線圖和響應面圖Fig.4 Contour and response surface plots showing the interactive effects of liquid/material ratio and length of extraction time on 700 nm absorbance of reducing power

圖4 顯示了在80℃的提取溫度下，液料比和提取時間對普通茶籽水溶性功能物質的還原能力的交互影響。在提取時間不變的條件下，隨著液料比水平的逐漸增加，還原能力出現先上升后下降的趨勢且變化較顯著。這可能是當液料比變大時，原料中溶質與水中溶質在單位時間內存在較大的質量濃度梯度，擴散系數大，擴散速率大[31]。但達到一定程度后，有效組分在溶劑中的溶解達到平衡，再加大液料比則會使競爭組分溶出而不利于提取。在液料比不變的條件下，隨著時間的逐漸增加，還原能力也出現了先上升后下降的趨勢，但變化不大。

2.2.3 液料比和提取溫度的交互影響

圖5 液料比和提取溫度對還原能力影響的等高線圖和響應面圖Fig.5 Contour and response surface plots showing the interactive effects of liquid/material ratio and extraction temperature on 700 nm absorbance of reducing power

圖5 顯示1.5h提取時間下，液料比和提取溫度對普通茶籽水溶性功能物質的還原能力的交互影響。在液料比不變的條件下，隨著提取溫度的逐漸增加，還原能力出現先上升后下降的趨勢。在提取溫度不變的條件下，隨著液料比水平的逐漸增加，還原能力也有明顯的先上升后下降的趨勢。這可能是因為溫度的升高加速了分子熱運動，而液料比的增大一方面使普通茶籽與溶劑的接觸面積和接觸機會也相對變大，另一方面使分子有更多的熱運動空間，從而使普通茶籽中的功能性物質得到更充分地釋放。

2.2.4 提取時間和提取溫度的交互影響

圖6 提取時間和提取溫度對還原能力影響的等高線圖和響應面圖Fig.6 Contour and response surface plots showing the interactive effects of extraction temperature and length of extraction time on 700 nm absorbance of reducing power

圖6 顯示在15:1(mL/g)液料比條件下，提取時間和提取溫度對普通茶籽中功能性物質的還原能力的交互影響。在提取時間不變的條件下，隨著提取溫度的逐漸增加，還原能力明顯上升，但隨后又呈下降趨勢。其原因可能是原料較長時間在較高溫度下提取，部分組織過熱而將有效組分的結構破壞[32-33]，導致還原能力下降。在提取溫度不變的條件下，隨著提取時間的逐漸增加，還原能力也出現先上升后下降的趨勢。

綜合圖4～6可知，液料比是影響普通茶籽功能性物質還原能力的最主要因素，其次是提取時間，提取溫度對其影響較小。在模型濃度范圍內選擇出發(fā)點，按照模型使用快速上升法進行優(yōu)化，提取的最佳條件為液

料比16.29:1(mL/g)、提取時間1.56h、提取溫度81.37℃，在此條件下還原能力(吸光度)的理論值為0.610，可信度為0.9893。

2.2.5 最佳工藝參數的驗證

為檢驗響應面分析法所得結果的可靠性，在上述條件下進行驗證實驗，考慮實際情況選取液料比16:1(mL/g)、提取時間1.6h、提取溫度81℃，實際測得的吸光度為0.616±0.005，與理論預測值較為一致。因此，認為基于響應面分析法所得的優(yōu)化提取工藝參數準確可靠，得到的提取條件具有一定的實際應用價值。

3 結 論

采用蒸餾水對普通茶籽中功能性物質進行提取，通過單因素試驗和Box-Behnken中心組合設計原理以及響應面分析法對提取工藝進行優(yōu)化，擬合了液料比、提取時間、提取溫度這3個因素對還原能力的回歸模型，經檢驗證明該模型合理可靠，能較好地預測普通茶籽中水溶性功能物質的還原能力。由該模型確定的最優(yōu)工藝條件為液料比16:1(mL/g)、提取時間1.6h、提取溫度81℃，在此條件下，得到普通茶籽功能性物質還原能力(實際吸光度)為0.616±0.005。

同時，試驗結果表明普通茶籽的水提物具有很好的還原能力，說明普通茶籽中可能含有相關的抗氧化功能活性物質，如酚類、多糖等。目前，國內外對普通茶籽的研究未見報道，因此，為了更好地說明普通茶籽的抗氧化功能，需對其水溶性活性物質做進一步的分離純化及鑒定。

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Response Surface Methodology for Optimization of Water Extraction Conditions of Antioxidant Compounds from Camellia sinensis Seeds

LI Qi-hong，ZHENG Tie-song*，WANG Hua-qing
(Department of Food Science and Nutrition, Ginling College, Nanjing Normal University, Nanjing 210097, China)

Camellia sinensis seed powder was extracted with hot water to obtain bioactive compounds with reducing power and three extraction parameters including liquid/material ratio, length of extraction time and extraction temperature were optimized using central composite design and response surface methodology based on single factor investigations for achieving maximum reducing power (reflected by 700 nm absorbance of the reaction system). A mathematical quadratic polynomial regression equation reflecting the relationship between extract reducing power and the above extraction parameters was set up. The optimal extraction parameters were found as follows: liquid/material ratio (mL/g) 16:1; extraction temperature 81 ℃; and length of extraction time 1.6 h. Under the optimized conditions, the actual 700 nm absorbance of reducing power was 0.616 ± 0.005, close to the predicted value of 0.610.

Camellia sinensis seeds；antioxidation；reducing power；response surface methodology

R151.3

A

1002-6630(2010)18-0170-05

2010-06-30

李起弘(1985—)，女，碩士研究生，研究方向為食品生物化學。E-mail：connie8512@hotmail.com

*通信作者：鄭鐵松(1963—)，男，教授，博士，研究方向為食品生物化學。E-mail：tieszheng@sina.com