酶改性對食物蛋白質(zhì)過敏原性的影響

程 偉，陳紅兵*，高金燕，李 欣

(1.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047；2.南昌大學(xué)中德聯(lián)合研究院，江西 南昌 330047；3.南昌大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，江西 南昌 330047；4.南昌大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，江西 南昌 330047)

酶改性對食物蛋白質(zhì)過敏原性的影響

程 偉1,2,3，陳紅兵1,2,*，高金燕4，李 欣4

(1.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047；2.南昌大學(xué)中德聯(lián)合研究院，江西 南昌 330047；3.南昌大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，江西 南昌 330047；4.南昌大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，江西 南昌 330047)

酶法改性蛋白技術(shù)主要包括酶水解和酶交聯(lián)方法，它可以改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能特性，已廣泛用于食品加工。酶水解，包括胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、糜蛋白酶，可以水解食物蛋白表面的過敏原表位，從而降低其過敏原性；酶交聯(lián)，包括轉(zhuǎn)谷酰胺酶、過氧化物酶、多酚氧化酶等，可以通過交聯(lián)反應(yīng)促使過敏原蛋白聚合而使其過敏原表位包裹在內(nèi)部，因而也可以降低食物的過敏原性。總之，酶改性是降低食物蛋白過敏原性的一種有效方法，值得深入研究。

酶法改性；酶水解；酶法交聯(lián)；過敏原性

食物過敏(food allergy，F(xiàn)A)是人體對食物產(chǎn)生的一種不良反應(yīng)，屬機(jī)體對外源物質(zhì)產(chǎn)生的一種變態(tài)反應(yīng)[1]。聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織(FAO，1995)認(rèn)定，常見的食物過敏反應(yīng)主要由八大類食物引起，包括牛奶、蛋類、花生、大豆、小麥、堅(jiān)果、魚蝦和水生貝殼類動(dòng)物[2-3]。由于食品加工會(huì)改變食品中過敏原蛋白的結(jié)構(gòu)，影響其過致敏性，因而受到人們的普遍關(guān)注。

酶法改性蛋白技術(shù)是食品加工中常用的加工技術(shù)之一。酶法改性蛋白技術(shù)是利用蛋白酶在溫和的條件下催化蛋白質(zhì)進(jìn)行水解或交聯(lián)，改變蛋白質(zhì)原有的空間結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化一方面可以改善蛋白質(zhì)的功能特性。如熱穩(wěn)定性、凝膠特性、乳化性、流變學(xué)特性、保水性等[4]，另一方面會(huì)影響蛋白質(zhì)的過敏原表位結(jié)構(gòu)，從而對食品中過敏原的致敏性產(chǎn)生影響。近年來，隨著食物過敏問題的日益嚴(yán)峻，低致敏食品的研發(fā)迫在眉睫?，F(xiàn)有研究報(bào)道已經(jīng)證實(shí)，多種常見蛋白酶可以通過催化食物蛋白水解或者交聯(lián)而降低其過敏原性，并可以此加工技術(shù)為依托研發(fā)出各種類型的低致敏食品[5-7]。

1 食品加工中的酶法改性蛋白技術(shù)

目前，按酶法改性蛋白技術(shù)的作用機(jī)理，主要分為兩類，包括酶法水解改性蛋白技術(shù)和酶法交聯(lián)改性蛋白技術(shù)。

酶法水解改性蛋白技術(shù)是利用一種或多種蛋白酶對食品蛋白進(jìn)行限制性水解的方法，它使蛋白水解成多肽或氨基酸，改變蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)或線性結(jié)構(gòu)，并可以達(dá)到改善蛋白質(zhì)功能特性的目的。常用的酶主要有胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、糜蛋白酶等。酶法交聯(lián)改性蛋白技術(shù)則是利用酶催化蛋白發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)的一種方法。該技術(shù)使蛋白質(zhì)內(nèi)部多肽鏈之間(分子內(nèi)交聯(lián))或蛋白質(zhì)之間(分子間)形成共價(jià)鍵[8]，改變蛋白質(zhì)原有的空間結(jié)構(gòu)，從而改善蛋白質(zhì)的一系列功能特性。常用于催化蛋白質(zhì)交聯(lián)的酶有轉(zhuǎn)谷酰胺酶、多酚氧化酶、過氧化物酶等。

2 酶改性對食物過敏原的影響

在酶法改性食品蛋白質(zhì)過程中，無論是水解或交聯(lián)，都會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，可能使蛋白質(zhì)內(nèi)部的某些表位發(fā)生變化，這種結(jié)構(gòu)的變化會(huì)影響食品蛋白的過敏原性。

2.1 酶法水解對食物過敏原的影響

酶水解改性蛋白對其過敏原的作用主要有兩個(gè)方面：一是通過對食品過敏蛋白的限制性水解，改變過敏原表位的三級結(jié)構(gòu)，去除過敏原蛋白表面的一些過敏原表位，或者將蛋白內(nèi)部的過敏原表位暴露出來；二是斷裂肽鍵，使蛋白質(zhì)部分水解成小肽或氨基酸，減小過敏原的分子質(zhì)量，從而可能降低其致敏性[9]。目前，國內(nèi)外已有許多關(guān)于酶水解對蛋白質(zhì)過敏原性影響的研究報(bào)道。

2.1.1 胃蛋白酶

胃蛋白酶(Pepsin) 是胃消化蛋白水解酶，屬于天冬氨酸蛋白水解酶類[10]，它主要作用于蛋白質(zhì)及多肽分子中含苯丙氨酸或酪氨酸的肽鍵上，其主要分解產(chǎn)物是胨，進(jìn)而產(chǎn)生多肽或氨基酸則較少。

Hussein等[11]用胃蛋白酶水解水牛和奶牛牛乳，檢測發(fā)現(xiàn)它們的水解產(chǎn)物對牛乳過敏患者血清的免疫活性分別只有原來的30%和16%，可見胃蛋白酶處理后的牛乳，其致敏性顯著降低；Hong等[12]研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)水解后的花生蛋白與IgE抗體結(jié)合的過敏原表位會(huì)部分消除，從而導(dǎo)致過敏原性下降，這種低致敏的水解產(chǎn)物可用于花生過敏病人的治療。此外，Lopez-Exposito等[13]在400MPa條件下，用胃蛋白酶催化水解卵白蛋白，并利用對卵白蛋白過敏的病人血清檢測其水解產(chǎn)物的過敏原性，發(fā)現(xiàn)由于卵白蛋白與IgE結(jié)合的位點(diǎn)被水解消除而導(dǎo)致其水解產(chǎn)物與IgE的結(jié)合能力顯著下降，以致降低了其致敏性。

2.1.2 胰蛋白酶

胰蛋白酶(Trypsin)是一種常用的蛋白水解酶，可專一作用于精氨酸、賴氨酸的羧基所形成的肽鍵，分子質(zhì)量為23.8kD[14]。在食品加工中，胰蛋白酶被廣泛用于水解蛋白質(zhì)。因此，它對食物蛋白過敏原的影響受到普遍關(guān)注。

Wigotzki等[15]發(fā)現(xiàn)用胰蛋白酶處理過的榛子，其過敏原性顯著降低。而Bernard等[16]用胰蛋白酶水解酪蛋白，則發(fā)現(xiàn)它可以水解肽鏈第1～52位和53～139位片段，這些多肽片段中包含有過敏原表位，經(jīng)水解后可以使酪蛋白的過敏原表位破壞，可以降低酪蛋白的過敏原性。此外，Szymkiewicz等[17]發(fā)現(xiàn)，用胰蛋白酶催化水解豌豆球蛋白后，其免疫反應(yīng)性比原蛋白降低了97.4%。

2.1.3 木瓜蛋白酶

木瓜蛋白酶(Papain)又稱木瓜酶，是一類半胱氨酸蛋白酶[18]。它對于多種蛋白質(zhì)均具有很好的水解作用，能催化水解肽鍵、酯鍵、酰胺鍵[19]，也可以影響食物的過敏原性。

陳寶宏等[6]研究出一種利用木瓜蛋白酶分解大米中的過敏原而生產(chǎn)低致敏大米的新方法。另外，白振宇等[20]則用木瓜蛋白酶水解牛奶，而后用牛奶過敏者血清檢測其水解產(chǎn)物的過敏原性，研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)酶解過的牛奶中過敏原蛋白與過敏者血清IgE的結(jié)合能力顯著降低，而降低了牛奶的過敏原性。

2.1.4 堿性蛋白酶

堿性蛋白酶(Alcalase)是一種微生物蛋白酶，來源廣泛、活力比較高、水解速度快、成本低，是較理想的工業(yè)用酶[21]。堿性蛋白酶是內(nèi)肽酶，主要催化由疏水性氨基酸的羧基形成的酰胺鍵，可水解蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的肽鍵，生成相對分子質(zhì)量較小的多肽，因而能破壞蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的抗原結(jié)合位點(diǎn)，有效降低蛋白的過敏原性[22]。

Wroblewska等[23]發(fā)現(xiàn)可以利用堿性蛋白酶水解乳清蛋白，降低乳清蛋白的抗原性，以此來制備低致敏牛奶。Szymkiewicz等[17]在50℃用堿性蛋白酶水解豌豆球蛋白，發(fā)現(xiàn)它的水解產(chǎn)物免疫反應(yīng)性降低到原來的22%，這說明豌豆球蛋白經(jīng)過堿性蛋白酶水解后，其過敏原性大大降低。此外，Penas等[24]利用此酶在200MPa下水解大豆乳清蛋白并檢測其水解產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)大豆中主要過敏原Gly m l 的過敏原性降低，進(jìn)一步研究表明這是由于過敏原Gly m l 的表位暴露在酶中而被水解，因而降低了大豆的免疫反應(yīng)性。

2.1.5 糜蛋白酶

糜蛋白酶又稱胰凝乳蛋白酶(Chymotrysin)，系從?；蜇i胰中提取的一種蛋白水解酶，具有肽鏈內(nèi)切酶的作用[25]，主要水解由芳香族氨基酸(如苯丙氨酸、酪氨酸等)的羧基與其他氨基酸的氨基所形成的肽鍵[26]。

利用糜蛋白酶的酶解特性，Lee等[27]用此酶水解大豆中主要過敏原大豆球蛋白，其水解產(chǎn)物用6個(gè)大豆過敏患者血清進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大豆的過敏原性顯著下降；Tanabe等[7]則研發(fā)出了一種用糜蛋白酶和鏈絲菌蛋白酶水解面粉，并制備低致敏面粉的方法；此外，Chicon等[28]在高壓下用糜蛋白酶處理乳清蛋白，發(fā)現(xiàn)其中的α-乳白蛋白與β-乳球蛋白被水解成較大的疏水多肽，降低了乳清蛋白的抗原性及其與血清中的IgE結(jié)合能力，減少了其潛在過敏性，可用于生產(chǎn)低致敏食品。

2.2 酶法交聯(lián)對食物過敏原的影響

酶法交聯(lián)改性蛋白質(zhì)，會(huì)使蛋白質(zhì)內(nèi)部多肽鏈之間或蛋白質(zhì)分子之間形成共價(jià)鍵，導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集，使原先暴露在表面的過敏原表位包埋入蛋白質(zhì)分子內(nèi)部而消除其過敏原性；但同時(shí)蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子間發(fā)生聚集，增大了蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量，形成了較大顆粒的蛋白，而有可能增大其致敏性。

雖然目前對酶交聯(lián)后產(chǎn)物的過敏原性變化研究較少，但隨著酶法交聯(lián)技術(shù)越來越多的應(yīng)用于食品加工中，酶交聯(lián)蛋白質(zhì)后對其過敏原性的影響越來受到人們的關(guān)注。

2.2.1 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶

轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(Transglutaminase，TG)是催化?；D(zhuǎn)移反應(yīng)的一種酶，可催化蛋白質(zhì)賴氨酸上ε-氨基和谷氨酸上γ-羥酰胺之間的結(jié)合反應(yīng)[29]，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-氨基酸之間發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)。通過這種蛋白質(zhì)交聯(lián)反應(yīng)，可使食品蛋白發(fā)生結(jié)構(gòu)變化，從而影響蛋白質(zhì)的過敏原性。Leszczynska等[30]研究出了一種利用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶生產(chǎn)低致敏面粉的方法：在30℃用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶處理面粉18h，用兔血清檢測產(chǎn)物中谷蛋白的過敏原性，發(fā)現(xiàn)其過敏原性降低了30%。Clare等[31]則在37℃用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶處理含有酪蛋白的花生粉6h后，生成了蛋白聚合物，用Western blotting進(jìn)一步檢測發(fā)現(xiàn)，花生粉中主要過敏原Ara h 1、Ara h 2與過敏病人血清中Ig E的結(jié)合能力顯著下降。由此可見谷氨酰胺酶催化的蛋白質(zhì)交聯(lián)反應(yīng)在一定程度上降低了食物的過敏原性。

2.2.2 過氧化物酶

過氧化物酶(Peroxidase，POD)是一種由單一肽鏈與卟啉構(gòu)成的血紅素蛋白，可催化多種酚類化合物的氧化[32]，也常用于催化蛋白質(zhì)交聯(lián)。它可以催化蛋白質(zhì)中的酪氨酸殘基轉(zhuǎn)變成自由基狀態(tài)，然后進(jìn)一步聚合生成二酪氨酸、三酪氨酸[33]，進(jìn)而導(dǎo)致蛋白質(zhì)交聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生。如，Chung等[34]發(fā)現(xiàn)，在37℃，pH8的環(huán)境下，用過氧化物酶處理烘烤花生60min后，花生中主要過敏原Ara h 1和Ara h 2顯著減少，同時(shí)可以觀察到該花生樣品與IgE的結(jié)合能力減弱，可能是由于此酶促使蛋白質(zhì)之間發(fā)生了交聯(lián)產(chǎn)生多聚體，使致敏蛋白上的結(jié)合部位被掩蔽，從而導(dǎo)致花生的過敏原性下降。

2.2.3 多酚氧化酶

多酚氧化酶(Polyphenoloxidase，PPO)屬核編碼含銅金屬酶，廣泛存在于植物、真菌、昆蟲機(jī)體中[35]。多酚氧化酶可催化蛋白交聯(lián)，其反應(yīng)原理如圖1所示[36]：

多酚氧化酶已成功地應(yīng)用于食物過敏原的研究中，如，Garcia等[37]研究發(fā)現(xiàn)，用多酚氧化酶催化處理蘋果中的主要過敏原Mal d 1，其產(chǎn)物與IgE的結(jié)合能力顯著下降，從而導(dǎo)致了Mal d 1的過敏原性的降低。

圖1 PPO催化蛋白質(zhì)產(chǎn)生交聯(lián)的原理圖Fig.1 Enzymatic cross-linking of proteins with polyphenol oxidase (PPO)

3 結(jié) 語

據(jù)統(tǒng)計(jì)，世界上有5%～8%的兒童和1%～2%的成

人患有食物過敏[38]，食物過敏的潛在性、廣泛性和長期性使其成為食品工業(yè)中重大的安全問題之一。美國和歐盟已先后頒布了新的食品標(biāo)簽法規(guī)，要求八大類過敏食品都應(yīng)在食品標(biāo)簽中明確標(biāo)示[39-40]，但這并不能從根本上解決食物過敏問題。消除或降低食品的過敏性，生產(chǎn)出低致敏或無致敏的“安全食品”已成為食品科學(xué)的研究熱點(diǎn)之一。

目前，利用酶水解牛乳生產(chǎn)低致敏嬰兒奶粉的技術(shù)已廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中[5]，在一定程度上降低了牛乳對過敏體質(zhì)兒童的危險(xiǎn)性。然而牛乳在酶解過程中，不可避免地會(huì)產(chǎn)生苦味肽，這大大影響了牛乳原有的風(fēng)味，制約著低致敏奶粉的發(fā)展。與此同時(shí)，利用酶改性技術(shù)研發(fā)其他種類低致敏食品尚處于起步階段，因此今后有必要加強(qiáng)以下幾個(gè)方面的應(yīng)用研究：1)探索利用新型蛋白酶水解食物過敏原，并利用已知食物過敏原表位信息對過敏原進(jìn)行定向水解，在降低食物致敏性的同時(shí)制備出風(fēng)味更佳的安全食品；2)深入研究酶交聯(lián)技術(shù)對食物蛋白質(zhì)過敏原性的影響，利用蛋白質(zhì)交聯(lián)包埋食物過敏原表位，并將此技術(shù)應(yīng)用于低致敏食品的開發(fā)?？傊?，酶法改性食品蛋白技術(shù)可以降低甚至消除食品的過敏原性，為低致敏食品的研發(fā)提供了一個(gè)很好的思路，具有廣闊的應(yīng)用前景。

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A Review of the Effect of Enzymatic Modification on the Allergenicity of Food Proteins

CHENG Wei1,2,3，CHEN Hong-bing1,2,*，GAO Jin-yan4，LI Xin4
(1. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China；2. Sino-German Joint Research Institute, Nanchang University, Nanchang 330047, China；3. School of Environmental and Chemical Engineering, Nanchang University, Nanchang 330047, China；4. School of Life Sciences and Food Engineering, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

Enzymatic modification of protein technology, including enzyme hydrolysis and enzymatic cross-linking technology, with modification of the protein structure thus resulting in the change of functional properties, has been widely used in food processing. However, the effect of enzymatic modification on the allergenicity of food proteins has not been explored in full detail. Enzymes like pepsin, trypsin, papain, alcalase, and chymotrysin may digest allergen epitopes in food proteins and decrease its allergenicity, while transglutaminase, peroxidase, and polyphenoloxidase may polymerize the allergen proteins, package the allergen epitopes by enzymatic cross-linking, and thus reduce its allergenincity. Therefore enzymatic modification is an effective method to reduce the allergenicity of food proteins and needs further study.

enzymatic modification；enzymic hydrolysis；enzymatic cross-linking；allergenicity

TS201.2

A

1002-6630(2010)23-0391-04

2010-08-03

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30860220)；教育部“新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計(jì)劃”項(xiàng)目(NCET-08-07-04)；南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室目標(biāo)導(dǎo)向項(xiàng)目(SKLF-MB-200807)

程偉(1986—)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)樯锛庸すこ?。E-mail：chv2005@163.com

*通信作者：陳紅兵(1967—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称窢I養(yǎng)與安全。E-mail：chbgjy@hotail.com