微波輻照誘變選育高產(chǎn)橙色素紅曲霉菌

徐 偉，范志誠(chéng)，劉艷華

(哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150076)

微波輻照誘變選育高產(chǎn)橙色素紅曲霉菌

徐 偉，范志誠(chéng)，劉艷華

(哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150076)

采用帶水循環(huán)冷卻裝置的微波設(shè)備，對(duì)紫紅曲(Monascus purpureus)進(jìn)行誘變處理，研究微波輻照功率和輻照時(shí)間對(duì)紅曲霉菌的致死規(guī)律和突變規(guī)律，獲得微波功率和時(shí)間的最佳輻照劑量，結(jié)果表明：在微波功率500W、輻照時(shí)間80s時(shí)，得到突變株W5S8，液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)橙色素色價(jià)為16.38U/mL，較原始菌株橙色素色價(jià)10.26U/mL提高了59.62%，連續(xù)遺傳5代，產(chǎn)色素性狀穩(wěn)定。

紅曲霉菌；微波輻照；橙色素；誘變

食品添加劑正朝著天然、安全、高效方向發(fā)展，國(guó)內(nèi)外對(duì)紅曲霉的研究大多集中在發(fā)酵生產(chǎn)天然紅色素、降膽固醇活性物質(zhì)等方面[1-3]。紅曲的防腐作用早有報(bào)道[4-5]，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，紅曲發(fā)酵產(chǎn)物中的重要抑菌成分為紅曲橙色素，可抑制革蘭氏陽(yáng)性菌以及大腸桿菌，橙色素也有增強(qiáng)免疫力、抗疲勞和降血脂等作用[6-8]。紅曲橙色素作為一種具有生理功效的天然色素和抑菌物質(zhì)，在需要著色和防腐的產(chǎn)品中都可以使用，因而，高產(chǎn)橙色素紅曲霉菌的育種工作具有重要的意義。

優(yōu)良的工業(yè)菌種是發(fā)酵工業(yè)的核心，誘變育種是目前大多數(shù)工業(yè)微生物育種重要且有效的技術(shù)[9]。微波輻照誘變微生物菌種，具有清潔、高效、設(shè)備簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，克服了紫外誘變易產(chǎn)生光修復(fù)現(xiàn)象的缺點(diǎn)[10-11]。本研究以一株從腐乳中分離的紫紅曲(Monascus purpureus)為出發(fā)菌株，微波輻照獲得高產(chǎn)橙色素的紅曲霉突變菌株，為紅曲防腐劑的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種

紫紅曲(Monascus purpureus)從腐乳中分離，經(jīng)中科院微生物研究所鑒定為紫紅曲。

1.2 培養(yǎng)基

固體培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20、麥芽糖5、蛋白胨10、酵母膏5、瓊脂20g，pH值自然；液體發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：大米粉60、黃豆粉5、葡萄糖3、NaNO34、酵母粉5、ZnSO40.2、MgSO41、K2HPO35。

1.3 微波輻照誘變裝置

目前進(jìn)行微波育種的研究人員一般采用普通的家用微波爐設(shè)備。在高功率微波輻照條件下，由于微波產(chǎn)生的熱效應(yīng)，會(huì)使菌種在短時(shí)間內(nèi)達(dá)到很高的熱致死

率，微波導(dǎo)致的基因突變性狀難以充分顯現(xiàn)，為防止誘變過(guò)程中菌體溫度過(guò)高致使孢子大量死亡，本實(shí)驗(yàn)采用自行設(shè)計(jì)的水循環(huán)冷卻裝置[12]保持微波輻照過(guò)程中菌懸液溫度的低溫環(huán)境，抵消一部分熱效應(yīng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)出發(fā)菌株的低溫輻照。

1.4 方法

1.4.1 孢子懸液的制備

菌種斜面在30℃培養(yǎng)7d，用無(wú)菌生理鹽水將孢子洗滌下來(lái)，倒入裝有已滅菌玻璃珠的三角瓶中，振蕩，將孢子打散，濾去菌絲體，制得孢子懸浮液，并調(diào)整孢子濃度至105個(gè)/mL。

1.4.2 微波輻照誘變方法

將已制備的濃度為105個(gè)/mL孢子懸液10mL移入無(wú)菌試管內(nèi)，并將該試管置于帶冷卻循環(huán)水的微波裝置中，在時(shí)間為90s時(shí)，分別以100～800W(間隔100W)功率進(jìn)行輻照處理，輻照功率為500W時(shí)，分別以10～150s(間隔10s)時(shí)間進(jìn)行輻照處理。對(duì)輻照后孢子懸液進(jìn)行倍比稀釋，涂布于平板固體培養(yǎng)基上，于30℃恒溫培養(yǎng)3d，記錄總菌落數(shù)和存活菌落數(shù)，計(jì)算致死率和突變率，確定最佳誘變條件。

1.4.3 菌株篩選

初篩：輻照后孢子懸液于30℃恒溫平板培養(yǎng)，7～10d后觀察菌落形態(tài)差異，選取形態(tài)和顏色變化較大的菌落，用無(wú)菌水洗滌孢子，分別制得孢子懸液，進(jìn)行復(fù)篩備用。

復(fù)篩：分別將初篩到的紅曲霉菌孢子懸液吸取10mL，接種于150mL液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度30℃、搖床轉(zhuǎn)速200r/min條件下培養(yǎng)14d，測(cè)定紅曲橙色素色價(jià)，挑選橙色素產(chǎn)量高的菌株進(jìn)行培養(yǎng)。

1.4.4 突變株的遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

將復(fù)篩得到的橙色素高產(chǎn)突變株連續(xù)傳代5次，分別于培養(yǎng)溫度30℃，搖床轉(zhuǎn)速180r/min條件下在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)14d，并測(cè)各代菌株所產(chǎn)橙色素色價(jià)。

1.4.5 橙色素色價(jià)測(cè)定[13]

吸取發(fā)酵液1mL加入裝有75%乙醇溶液9mL的試管中，加塞、搖勻，靜置20min后，用快速濾紙過(guò)濾得清液，再適當(dāng)稀釋，用75%乙醇溶液作空白對(duì)照，用紫外分光光度計(jì)在橙色素最大吸收波長(zhǎng)465nm處測(cè)定OD值，將OD值乘以稀釋倍數(shù)，即為橙色素色價(jià)。橙色素色價(jià)計(jì)算公式如下：

橙色素色價(jià)/(U/mL)=OD465nm×稀釋倍數(shù)

2 結(jié)果與分析

2.1 微波輻照功率和輻照時(shí)間對(duì)紅曲霉菌致死率的影響

考察輻照時(shí)間90s時(shí)，微波功率不同輻照劑量對(duì)紅曲霉的致死規(guī)律，同時(shí)進(jìn)行微波功率為500W，不同輻照時(shí)間的紅曲霉菌致死率實(shí)驗(yàn)。對(duì)輻照后菌懸液進(jìn)行梯度稀釋，選取稀釋度10-3、10-4菌懸液涂布平板上，各稀釋度做3個(gè)平行樣，在溫度30℃培養(yǎng) 3d，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，計(jì)算致死率，結(jié)果如圖1所示。

圖1 微波功率和輻照時(shí)間與致死率的關(guān)系Fig.1 Correlation of microwave power and irradiation duration with lethal rate ofMonascus purpureus

由圖1可知，微波輻照時(shí)間不變，致死率隨微波輻照功率提高而增大；在微波功率不變時(shí)，致死率隨著微波輻照時(shí)間延長(zhǎng)而增大。據(jù)資料顯示[14]，紅曲霉菌在致死率為60%～90%時(shí)，菌株突變率大，本實(shí)驗(yàn)得到微波輻照90s，功率300～600W時(shí)，致死率恰好在60%～90%之間；微波功率為500W，輻照時(shí)間60～90s時(shí)，致死率也在60%～90%之間，因此，選擇輻照功率范圍為300～600W時(shí)，輻照時(shí)間在60～90s時(shí)，進(jìn)行橙色素突變菌株的研究。

2.2 微波輻照劑量對(duì)紅曲霉菌橙色素產(chǎn)量的影響

2.2.1 微波輻照功率對(duì)紅曲霉菌橙色素產(chǎn)量的影響

時(shí)間為90s時(shí)，對(duì)微波功率300、400、500、600W的4個(gè)劑量組輻照后的孢子懸液進(jìn)行平板培養(yǎng)，分別挑取15株菌進(jìn)行搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，測(cè)定橙色素色價(jià)，結(jié)果如圖2～5 所示，其中0號(hào)菌株為原始菌株。

圖2 300W微波輻照90s菌株產(chǎn)橙色素色價(jià)Fig.2 Color value of orange pigments produced byMonascus purpureusunder the microwave power of 300 W and irradiation duration of 90 s

圖3 400W微波輻照90s菌株產(chǎn)橙色素色價(jià)Fig.3 Color value of orange pigments produced byMonascus purpureusunder the microwave power of 400 W and irradiation duration of 90 s

圖4 500W微波輻照90s菌株產(chǎn)橙色素色價(jià)Fig.4 Color value of orange pigments produced byMonascus purpureusunder the microwave power of 500 W and irradiation duration of 90 s

圖5 600W微波輻照90s菌株產(chǎn)橙色素色價(jià)Fig.5 Color value of orange pigments produced byMonascus purpureusunder the microwave power of 600 W and irradiation duration of 90 s

本實(shí)驗(yàn)考慮檢測(cè)誤差，限定產(chǎn)橙色素色價(jià)超過(guò)原始菌株5%以上為正突變、±5%以內(nèi)為未突變、-5%以下為負(fù)突變，與原始菌株比較，計(jì)算各段內(nèi)菌株的百分?jǐn)?shù)，結(jié)果如表1所示。

由表1可知，在輻照時(shí)間90s條件下，正突變率隨微波輻照功率增大而先增大后減小，在功率為500W時(shí)，正突變率最高為47%，得到橙色素色價(jià)為16.05U/ mL的突變株W5S9，該菌株比未照射組提高了56.43%。300W時(shí)得突變株W3S9，產(chǎn)橙色素色價(jià)為13.29U/mL，提高了29.53%；400W時(shí)得突變株W4S9，產(chǎn)橙色素色價(jià)為14.63U/mL，提高了42.59%；600W時(shí)得突變株W6S9，產(chǎn)橙色素色價(jià)為15.81U/mL，提高了54.09%。

表1 微波時(shí)間90s時(shí)不同輻照功率的紅曲霉菌株突變比例Table 1 Mutation rate ofMonascus purpureusunder different microwave powers and irradiation duration of 90 s

2.2.2 微波輻照時(shí)間對(duì)紅曲霉菌橙色素產(chǎn)量的影響

圖6 500W微波輻照60s菌株產(chǎn)橙色素色價(jià)Fig.6 Color value of orange pigments produced byMonascus purpureusunder the microwave power of 500 W and irradiation duration of 60 s

圖7 500W微波輻照70s菌株產(chǎn)橙色素色價(jià)Fig.7 Color value of orange pigments produced byMonascus purpureusunder the microwave power of 500 W and irradiation duration of 70 s

圖8 500W微波輻照80s菌株產(chǎn)橙色素色價(jià)Fig.8 Color value of orange pigments produced byMonascus purpureusunder the microwave power of 500 W and irradiation duration of 80 s

功率為500W時(shí)，對(duì)輻照時(shí)間60、70、80、90s的4個(gè)劑量組輻照后的孢子懸液進(jìn)行平板培養(yǎng)，分別挑取15株菌，進(jìn)行搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，測(cè)定橙色素色價(jià)，結(jié)果如圖4、圖6～8 及表2所示，其中0號(hào)菌株為原始菌株

表2 微波功率500W不同輻照時(shí)間時(shí)紅曲霉突變菌株比例Table 2 Mutation rate ofMonascus purpureusunder different microwave irradiation duration and microwave power of 500 W

由表2可知，正突變率隨微波輻照時(shí)延長(zhǎng)間而先增大后減小，其中微波輻照500W，輻照時(shí)間為80s時(shí)正突變率最高為53%，可得突變株W5S8，產(chǎn)橙色素色價(jià)為16.38U/mL，比未照射組提高了59.62%。功率500W輻照時(shí)間60s時(shí)，得突變株W5S6，產(chǎn)橙色素色價(jià)為15.02U/mL，比未照射組提高了46.39%；輻照時(shí)間70s時(shí)，得突變株W5S7，產(chǎn)橙色素色價(jià)為15.93U/mL，比未照射組提高了55.26%。

2.3 微波輻照突變株的穩(wěn)定性

通過(guò)對(duì)原始菌株與輻照后菌株的菌落形態(tài)觀察對(duì)比發(fā)現(xiàn)，突變菌株的菌落形態(tài)和顏色、孢子大小、菌絲粗細(xì)均有不同程度變化。突變株W5S8較原始株菌落直徑變大，菌落顏色加深，氣生菌絲也更加濃密，將紅曲霉突變株W5S8接種于斜面培養(yǎng)基，連續(xù)傳代5次，進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵，測(cè)定橙色素色價(jià)。其橙色素色價(jià)分別為16.38、16.34、16.42、16.39、16.41U/mL，說(shuō)明產(chǎn)橙色素遺傳穩(wěn)定性較好。

3 討 論

采用水循環(huán)冷卻裝置的微波設(shè)備，克服了在高功率輻照時(shí)，短時(shí)間內(nèi)熱致死率高、基因突變率低的問(wèn)題。通過(guò)考察微波輻照功率和時(shí)間對(duì)紅曲霉菌株突變率的影響，可知，正突變率隨微波輻照劑量增大而增大，但超過(guò)一定劑量，正突變率下降。微波是一種電磁波，能引起水、蛋白質(zhì)、核苷酸、脂肪和碳水化合物等極性分子轉(zhuǎn)動(dòng)，尤其是水分子在2450MHz微波作用下，能在1s內(nèi)180°來(lái)回轉(zhuǎn)動(dòng)24.5×108次，從而，引起分子間強(qiáng)烈的摩擦，使得菌體細(xì)胞內(nèi)DNA分子氫鍵和堿基堆集化學(xué)力受損，最終引起DNA分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導(dǎo)致遺傳變異。

微生物在未接受到足夠損傷造成突變的照射之前，由于蛋白質(zhì)、酶的活性都會(huì)不斷地變化，在某一范圍內(nèi)，恰好使細(xì)胞內(nèi)合成蛋白質(zhì)或酶的活性達(dá)到最大，此時(shí)，就大大地提高了孢子分裂增殖速度。當(dāng)然強(qiáng)度過(guò)大，也會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性、酶失活、孢子死亡、致死率增大[15]。在微波輻照功率500W、輻照時(shí)間80s條件下，紅曲霉產(chǎn)橙色素色價(jià)正突變率高。因此，微波誘變應(yīng)用于紅曲霉菌株選育簡(jiǎn)便、有效，為紅曲橙色素在食品防腐抑菌中應(yīng)用提供了技術(shù)支持。

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Mutation Breeding of Monascus purpureus with High Productivity of Orange Pigments by Microwave Irradiation

XU Wei，F(xiàn)AN Zhi-cheng，LIU Yan-hua
(College of Food Engineering, Harbin University of Commerce, Harbin 150076, China)

Microwave irradiation with water-cooling device was used for the mutagenesis of Monascus purpureus. The optimal microwave power, irradiation duration and dosage for the mutagenesis of Monascus purpureus were explored by evaluating the lethal and mutation regularity of Monascus purpureus. Results indicated that the optimal mutation conditions were microwave power of 500 W and irradiation duration of 80 s. Under the optimal microwave irradiation conditions, a mutated strain W5S8 with the highest productivity of orange pigments was achieved and the color value of orange pigments from strain W5S8 was 16.38 U/mL, which was increased by 59.62% compared with the parent strain. Its productivity for orange pigments remained stable after subculture for 5 generations or storage.

Monascus purpureus；microwave irradiation；orange pigment；mutation

TS202.3

A

1002-6630(2010)23-0224-04

2010-09-20

黑龍江省科技廳重大科技攻關(guān)項(xiàng)目(GA07B401-3)

徐偉(1963—)，女，副教授，博士，研究方向?yàn)榘l(fā)酵工程。E-mail：xuwei20070808@yahoo.com.cn