冷藏牙鲆中主要腐敗菌卵黃抗體的抑菌性能

胥亞夫，林 洪，張 茜，田良良，趙 碩，隋建新，曹立民*

(中國(guó)海洋大學(xué)水產(chǎn)品安全實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266003)

冷藏牙鲆中主要腐敗菌卵黃抗體的抑菌性能

胥亞夫，林 洪，張 茜，田良良，趙 碩，隋建新，曹立民*

(中國(guó)海洋大學(xué)水產(chǎn)品安全實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266003)

根據(jù)菌落形態(tài)、生理生化特征，利用細(xì)菌鑒定系統(tǒng)，對(duì)4℃冷藏養(yǎng)殖牙鲆貨架期終點(diǎn)時(shí)的主要腐敗菌進(jìn)行定性和定量研究。最終確定4℃冷藏貨架期終點(diǎn)時(shí)養(yǎng)殖牙鲆的優(yōu)勢(shì)腐敗菌為腐敗希瓦氏菌，占細(xì)菌總數(shù)的比例約為58.4%。水產(chǎn)品中常見(jiàn)的腐敗菌假單胞菌屬細(xì)菌主要包括熒光假單胞菌、腐臭假單胞菌和邊緣假單胞菌，它們?cè)诩賳伟鷮僦兴嫉谋攘幸来问?3.2%、29.2%、7.6%。以3種主要的腐敗菌腐敗希瓦氏菌、熒光假單胞菌和腐臭假單胞菌作為混合抗原，以兩種不同方式免疫產(chǎn)蛋母雞，制備兩種卵黃抗體，并對(duì)其液體和固體培養(yǎng)條件下的抑菌效果進(jìn)行研究。結(jié)果表明：液體培養(yǎng)8h，質(zhì)量濃度為100mg/mL的兩種混合抗體對(duì)抗原菌的抑制率能達(dá)到61%～78%； 固體培養(yǎng)24h后， 同樣質(zhì)量濃度的兩種混合抗體對(duì)抗原菌的抑制率能達(dá)到27%～40%。這表明卵黃抗體有望作為一種新型的天然抑菌劑應(yīng)用于水產(chǎn)食品的抑菌防腐。

牙鲆；優(yōu)勢(shì)腐敗菌；腐敗希瓦氏菌；假單胞菌屬；卵黃免疫球蛋白；抑菌活性

引起水產(chǎn)品腐敗變質(zhì)的主要原因是細(xì)菌的生長(zhǎng)代謝，且大多數(shù)情況下只有部分菌種參與了腐敗過(guò)程。在特定的原料、加工、流通、貯藏等因素條件下，能夠較好地適應(yīng)并繁殖的個(gè)別微生物逐漸占據(jù)優(yōu)勢(shì)地位，并產(chǎn)生腐敗臭味和異味的代謝產(chǎn)物，這種微生物即被稱為該產(chǎn)品的特定腐敗菌(SSO)[1]。在凍結(jié)溫度以上，魚(yú)類的特定腐敗菌主要是一些嗜冷性細(xì)菌[2]，而且同類型產(chǎn)品中往往只有一種或幾種微生物總是作為腐敗菌出現(xiàn)，已有對(duì)于沙丁魚(yú)、大黃魚(yú)、羅非魚(yú)等品種的研究證實(shí)，這些魚(yú)類在有氧冷藏或者冰藏條件下的SSO一般

以假單胞菌屬的細(xì)菌以及腐敗希瓦氏菌為主[3-6]。

開(kāi)發(fā)安全的天然生物保鮮劑代替?zhèn)鹘y(tǒng)的化學(xué)合成防腐劑是食品防腐劑發(fā)展的方向，如殼聚糖、茶多酚等天然保鮮劑已經(jīng)被廣泛地用于降低魚(yú)肉的腐敗程度[7]。卵黃免疫球蛋白(IgY)簡(jiǎn)稱卵黃抗體，由于制備簡(jiǎn)單，具有較好的熱穩(wěn)定性和耐酸堿性已經(jīng)得到越來(lái)越多的關(guān)注[8]。而且卵黃抗體還具有一個(gè)非常重要的性質(zhì)就是它對(duì)其抗原菌的生長(zhǎng)具有顯著地抑制作用，大量的研究已經(jīng)證實(shí)卵黃抗體的體內(nèi)和體外抑菌特性[9-11]。

牙鲆目前是我國(guó)重要的海水增養(yǎng)殖魚(yú)類之一，肉嫩味美，營(yíng)養(yǎng)豐富，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和發(fā)展前景[12]。隨著近年來(lái)養(yǎng)殖產(chǎn)量的持續(xù)增加，對(duì)其加工及保鮮技術(shù)的研究就顯得愈加重要。目前對(duì)于冷藏養(yǎng)殖牙鲆貨架期終點(diǎn)時(shí)的優(yōu)勢(shì)腐敗菌的分析，以及應(yīng)用卵黃抗體抑制水產(chǎn)品中腐敗菌的相關(guān)研究至今未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究主要對(duì)4℃冷藏養(yǎng)殖牙鲆貨架期終點(diǎn)時(shí)的主要腐敗菌進(jìn)行分離鑒定，并篩選出3種主要的腐敗菌作為混合抗原菌制備卵黃抗體，然后通過(guò)液體和固體培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)初步驗(yàn)證卵黃抗體對(duì)主要腐敗菌的生長(zhǎng)抑制效應(yīng)。從而為進(jìn)一步將其應(yīng)用于實(shí)際水產(chǎn)樣品，開(kāi)發(fā)一種新型的生物保鮮產(chǎn)品提供實(shí)驗(yàn)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

養(yǎng)殖牙鲆于2009年5月購(gòu)買(mǎi)于青島市南山水產(chǎn)市場(chǎng)，產(chǎn)地為山東省威海市，活體運(yùn)輸?shù)綄?shí)驗(yàn)室。敲頭致死，無(wú)菌生理鹽水清洗，然后無(wú)菌操作條件下，去頭、去內(nèi)臟、去鱗和鰓，切片，每片大約5 0 g，然后每片魚(yú)肉分別用無(wú)菌樣品袋包裝后，4℃冷藏條件下貯藏。

假單胞菌C F C選擇性培養(yǎng)基；營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(NA)；福氏完全佐劑、福氏不完全佐劑、辣根酶標(biāo)記兔抗雞IgG Sigma公司；牛血清白蛋白(BSA) 北京索萊寶公司；硫酸銨(優(yōu)級(jí)純) 天津科密歐化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心；萊亨蛋雞 青島森淼公司下屬養(yǎng)殖場(chǎng)。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2FD潔凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；WGP-350隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；VITEK 2 COMPACT 全自動(dòng)微生物鑒定儀法國(guó)生物梅里埃股份有限公司；BIOLOG自動(dòng)微生物鑒定儀 美國(guó)Biolog公司。

1.3 貨架期終點(diǎn)判定

1.3.1 感官和化學(xué)指標(biāo)

由6名經(jīng)過(guò)訓(xùn)練的評(píng)價(jià)員組成感官評(píng)定小組，對(duì)牙鲆樣品的氣味、色澤、質(zhì)地等進(jìn)行綜合評(píng)定打分。分為0～5分，5分為好，4分為較好，3分為一般，2分為較差，1分為很差。對(duì)6人所打分?jǐn)?shù)取平均值，當(dāng)平均值低于2.5時(shí)即判定為貨架期終點(diǎn)；按照GB/T5009. 44—1996測(cè)定揮發(fā)性鹽基氮(TVBN)。

1.3.2 細(xì)菌總數(shù)的測(cè)定

取出魚(yú)肉，在無(wú)菌條件下勻漿，稱取魚(yú)肉勻漿3g，加入27mL無(wú)菌生理鹽水制成10-1稀釋液，振蕩后，以10倍遞增稀釋法進(jìn)一步制成10-2、10-3和10-4等稀釋度的稀釋液，取100μL各稀釋度的稀釋液分別涂布于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板表面，25℃培養(yǎng)24h后計(jì)數(shù)，每個(gè)稀釋度作3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。

1.4 貨架期終點(diǎn)時(shí)主要腐敗菌株分離及鑒定

優(yōu)勢(shì)腐敗菌的分離：在貨架期終點(diǎn)時(shí)細(xì)菌總數(shù)測(cè)定的培養(yǎng)基平板上，經(jīng)肉眼觀察菌落形態(tài)進(jìn)行簡(jiǎn)單分類，選取其中數(shù)量?jī)?yōu)勢(shì)較為明顯的菌種進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，并從中挑選出合適大小的單菌落，平板劃線法分離純化，25℃培養(yǎng)24h。

假單胞菌的分離：同樣取100μL各稀釋度的稀釋菌液，分別涂布于假單胞菌CFC選擇性培養(yǎng)基平板表面，25℃培養(yǎng)24h。選取菌數(shù)合適(通常20～200個(gè)菌落)的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，同時(shí)依據(jù)菌落形態(tài)、革蘭氏染色、運(yùn)動(dòng)性等特征進(jìn)行細(xì)菌分組，每組挑選所有菌落或若干菌落(至少2～3個(gè)菌落)，分離純化，25℃培養(yǎng)24h。

菌種鑒定：參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[13]，綜合菌落形態(tài)、細(xì)胞形態(tài)學(xué)、生理生化等特征，利用Vitek和Biolog微生物鑒定系統(tǒng)對(duì)分離純化的菌株進(jìn)行鑒定。

1.5 動(dòng)物免疫

貨架期終點(diǎn)時(shí)從牙鲆中分離的3種主要腐敗菌分別接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，于25℃培養(yǎng)24h，4000r/min離心30min收集菌體，然后于1%甲醛溶液中滅活48h，營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板檢測(cè)沒(méi)有活菌后備用。然后用生理鹽水將滅活的菌體細(xì)胞調(diào)節(jié)至一定濃度，采用兩種不同的免疫方式：1)按照一定比例制成混合抗原(2:1:1)，使最終3種菌體細(xì)胞濃度分別為2×109、1×109CFU/mL和1× 109CFU/mL。取菌懸液與福氏完全佐劑按1:1混合后充分乳化，于雞的雙翅及胸肌處皮下散點(diǎn)注射(1mL/只)，2、6、10周后換為福氏不完全佐劑加強(qiáng)免疫注射。2)先注射一種菌體(濃度為2×109CFU/mL)，2、4d后分別注射另外兩種菌體(濃度均為1×109CFU/mL)，然后于2、6、10周后換為福氏不完全佐劑加強(qiáng)免疫，每次免疫3種菌體的注射時(shí)間均相隔2d。每周收集免疫后的雞蛋，4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩Ｍ瑫r(shí)以不注射免疫的雞蛋制備非特異性抗體作為陰性對(duì)照。

1.6 特異性IgY的提取和效價(jià)測(cè)定

特異性IgY的提取是采用硫酸銨鹽析的方法[14]，取免疫后蛋黃20g，按1:10(m/V)用雙蒸水稀釋，混合均勻后用0.1mol/L的HCl調(diào)節(jié)pH至5.1±0.1，4℃靜置過(guò)夜。4℃、4000r/min離心20min，取上清液過(guò)濾。然后向?yàn)V液中分別加入50%和33%飽和度的硫酸銨進(jìn)行二次鹽析，離心后收集沉淀并溶解于適量的磷酸鹽緩沖液(PBS)中，透析后即為IgY溶液。兩種免疫方式和沒(méi)有免疫的雞蛋中提取的IgY分別稱為M1-IgY、M2-IgY和N-IgY。

間接酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定IgY效價(jià)采用傳統(tǒng)操作步驟[15]：以109CFU/mL的兩種主要的腐敗菌菌體抗原分別包被96孔板，以PBS和陰性IgY提取液作為空白和陰性對(duì)照，濃度與陽(yáng)性抗體的稀釋梯度一致。抗體的效價(jià)定義為：樣品OD450nm值(P)與陰性對(duì)照OD450nm值(N)的比值P/N≥2.1時(shí)所需要的樣品最大稀釋倍數(shù)。

1.7 IgY抑菌效果實(shí)驗(yàn)[9,11]

液體抑菌：將達(dá)到一定效價(jià)的M1-IgY和M2-IgY抗體分別用營(yíng)養(yǎng)肉湯(NB)稀釋至100mg/mL(以抗體凍干粉計(jì))，0.22μm 微孔濾膜除菌后取6mL放入血清瓶中，然后每個(gè)血清瓶加入100mL的菌體溶液，使最終菌體細(xì)胞濃度為108CFU/mL，空白對(duì)照則加入6mL NB培養(yǎng)基。陰性對(duì)照是將沒(méi)有免疫的雞蛋中提取的N-IgY用營(yíng)養(yǎng)肉湯(NB)稀釋至100mg/mL，取6mL于血清瓶中，然后加入菌體溶液，使最終菌體細(xì)胞濃度為108CFU/mL。于25℃振搖培養(yǎng)，每隔2h于600nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。同時(shí)，制作兩種主要的腐敗菌菌體細(xì)胞濃度和OD600nm之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲線。

固體抑菌：待平板中的N A培養(yǎng)基凝固后，用100mg/mL的特異性IgY溶液6mL表面浸泡處理30min，取出IgY抗體30min后取20μL約104CFU/mL的菌液重新涂布平板，25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，計(jì)算菌落總數(shù)。同時(shí)用未經(jīng)IgY處理的平板以相同濃度和體積的菌液進(jìn)行空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)，以相同濃度的N-IgY處理的平板進(jìn)行陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 貨架期終點(diǎn)判定

通過(guò)感官評(píng)定、TVBN和細(xì)菌總數(shù)的測(cè)定，判斷4℃冷藏條件下，養(yǎng)殖牙鲆在第9天時(shí)達(dá)到貨架期終點(diǎn)。對(duì)應(yīng)的感官評(píng)分為(2.23±0.26)＜2.5分，TVB-N值為(30.73±0.70)mg/100g，細(xì)菌總數(shù)值為(7.25± 0.09)lg (CFU/g)。TVBN值被廣泛的用作肉類腐敗的指標(biāo)，根據(jù)GB 2733—1994，TVB-N30mg/100g是魚(yú)肉腐敗的最高可接受水平。在第9天， 牙鲆腐敗初期TVB-N大約為30.73mg/100g，同時(shí)，細(xì)菌總數(shù)達(dá)到了7.25lg(CFU/g)，高于原料魚(yú)肉腐敗的最大推薦值7.0lg(CFU/g)[16]，這從化學(xué)和微生物指標(biāo)表明養(yǎng)殖牙鲆在第9天時(shí)達(dá)到貨架期終點(diǎn)。

2.2 腐敗菌的分類及鑒定

貨架期終點(diǎn)時(shí)，在稀釋度為4的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，共分離出195株細(xì)菌，根據(jù)肉眼觀察菌落形態(tài)和形態(tài)學(xué)特征分類發(fā)現(xiàn)，只有一種細(xì)菌占有明顯的數(shù)量?jī)?yōu)勢(shì)，其數(shù)量為114株，其余種類細(xì)菌的數(shù)量都相對(duì)非常有限，而且分布較為分散，因此初步判斷其中數(shù)量最多的一類細(xì)菌為優(yōu)勢(shì)腐敗菌，菌落形態(tài)特征見(jiàn)表1(第1組)，分離純化后通過(guò)Vitek和Biolog微生物鑒定系統(tǒng)對(duì)其生理生化特征，碳源利用代謝特征進(jìn)行鑒定，確定其為腐敗希瓦氏菌(Shewanella putrefaciens)，該菌在貨架期終點(diǎn)時(shí)占細(xì)菌總數(shù)的58.4%，因此判定牙鲆在冷藏過(guò)程中貨架期終點(diǎn)時(shí)的優(yōu)勢(shì)腐敗菌為腐敗希瓦氏菌。

采用傳統(tǒng)表現(xiàn)型實(shí)驗(yàn)對(duì)在稀釋度為3的假單胞菌CFC選擇性培養(yǎng)基平板上獲得的138株細(xì)菌進(jìn)行初步鑒定，均呈現(xiàn)革蘭氏陰性，具有運(yùn)動(dòng)性，符合假單胞菌屬的一般特征，但菌落形態(tài)存在一定差異，可進(jìn)一步分為3類，菌落特征見(jiàn)表1(第2～4組)。假單胞菌屬細(xì)菌在貨架期終點(diǎn)時(shí)占細(xì)菌總數(shù)的7.1%，通過(guò)Vitek和Biolog微生物鑒定系統(tǒng)對(duì)其鑒定分別為熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)、腐臭假單胞菌(Pseudomonas taetrolens)和邊緣假單胞菌(Pseudomonas marginalis)，它們?cè)诩賳伟鷮僦械谋壤来螢?3.2%、29.2%、7.6%。

表1 所分離純化的4組微生物的菌落形態(tài)特征Table 1 Colony morphological characteristics of four strains isolated

海產(chǎn)魚(yú)初始細(xì)菌菌相與魚(yú)類生存及捕獲環(huán)境、季節(jié)、捕獲方法相關(guān)，在流通、加工、貯藏過(guò)程中的菌相變化則受多種因子制約，其中溫度是主要影響因子之一[17]。在低溫冷藏過(guò)程中，部分嗜冷微生物生長(zhǎng)增殖速度比其他種類的細(xì)菌快，逐漸占據(jù)優(yōu)勢(shì)地位并產(chǎn)生感官不能接受的代謝產(chǎn)物而導(dǎo)致魚(yú)品腐敗，即成為冷藏過(guò)程中的特定腐敗菌(SSO)[1]。目前國(guó)內(nèi)外一般認(rèn)為在冷藏過(guò)程中，耐冷的革蘭氏陰性細(xì)菌腐敗希瓦氏菌和假單胞菌往往是優(yōu)勢(shì)腐敗菌，這對(duì)于很多種魚(yú)、貝類和甲殼類都是適用的，無(wú)論是溫帶水域、亞熱帶水域和熱帶水域[18]。腐敗希瓦氏菌是海洋性革蘭氏陰性菌，

腐敗活性強(qiáng)，能產(chǎn)生H2S、還原TMAO等，是常見(jiàn)的冷藏海產(chǎn)魚(yú)類腐敗菌之一 ；假單胞菌屬細(xì)菌則在淡水魚(yú)和海水魚(yú)都有報(bào)道，雖然不產(chǎn)生H2S和還原T M A O，但產(chǎn)生大量醛、酮、酯等產(chǎn)物，從而導(dǎo)致感官品質(zhì)的下降[19]。本研究的結(jié)果與之前的報(bào)道基本吻合，腐敗希瓦氏菌和熒光假單胞菌是牙鲆中兩種主要的腐敗菌，同時(shí)腐敗希瓦氏菌又是優(yōu)勢(shì)腐敗菌，考慮到其數(shù)量上的優(yōu)勢(shì)，應(yīng)在今后的加工和保藏過(guò)程中重點(diǎn)予以監(jiān)控。

2.3 特異性IgY抗體效價(jià)測(cè)定

M1-IgY和M2-IgY抗體對(duì)腐敗希瓦氏菌和熒光假單胞菌產(chǎn)生的效價(jià)如圖1、2所示。 ELISA測(cè)定結(jié)果表明M1-IgY和M2-IgY對(duì)腐敗希瓦氏菌的效價(jià)分別為1:1000、1:2000(圖1)，對(duì)熒光假單胞菌的效價(jià)分別為1:2000、1:5000(圖2)。無(wú)論是對(duì)腐敗希瓦氏菌還是熒光假單胞菌，M2-IgY表現(xiàn)出更高的效價(jià)。

圖1 混合抗體對(duì)腐敗希瓦氏菌的效價(jià)(n=3)Fig.1 Titer of mixed IgY againstShewanella putrefaciens(n=3)

圖2 混合抗體對(duì)熒光假單胞菌的效價(jià)(n=3)Fig.2 Titer of mixed IgY againstPseudomonas fluorescens(n=3)

2.4 液體培養(yǎng)條件下IgY的抑菌效果

由于腐敗希瓦氏菌和熒光假單胞菌是冷藏養(yǎng)殖牙鲆中兩種主要的腐敗菌，所以進(jìn)行兩種混合IgY對(duì)腐敗希瓦氏菌和熒光假單胞菌抑制作用的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，首先進(jìn)行常規(guī)的液體培養(yǎng)生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖3、4所示。在菌體生長(zhǎng)的初期(2h)，特異性IgY抗體對(duì)兩種菌的生長(zhǎng)影響并不明顯，但經(jīng)過(guò)4h后，陰性抗體N-IgY對(duì)兩種菌依然沒(méi)有顯示明顯的抑制作用，而培養(yǎng)基中加入M1-IgY和M2-IgY抗體的，腐敗希瓦氏菌和熒光假單胞菌的生長(zhǎng)開(kāi)始受到抑制，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，這種抑制作用也逐漸顯著。 根據(jù)腐敗希瓦氏菌菌體細(xì)胞與OD600nm的對(duì)應(yīng)關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖5)，當(dāng)培養(yǎng)8h時(shí)，與空白對(duì)照相比，100mg/mL 的M1-IgY和M2-IgY抗體分別可以使腐敗希瓦氏菌減少61.6%和67.2%。根據(jù)熒光假單胞菌菌體細(xì)胞與OD600nm的對(duì)應(yīng)關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖6)，當(dāng)培養(yǎng)8h，100mg/mL 的M1-IgY和M2-IgY抗體分別可以使熒光假單胞菌減少69.2%和77.8%。在培養(yǎng)的過(guò)程中，無(wú)論是對(duì)腐敗希瓦氏菌還是熒光假單胞菌，M2-IgY抗體的抑菌效果要高于M1-IgY的抑菌效果，這應(yīng)該是與M2-IgY的效價(jià)比M1-IgY抗體的效價(jià)高有關(guān)。

圖3 25℃營(yíng)養(yǎng)肉湯中混合IgY對(duì)腐敗希瓦氏菌的抑菌性能(n=3)Fig.3 Growth curves ofShewanella putrefaciensin the presence of two IgYs at 25 ℃ (n=3)

圖4 25℃營(yíng)養(yǎng)肉湯中混合IgY對(duì)熒光假單胞菌的抑菌性能(n=3)Fig.4 Growth curves ofPseudomona fluorescensin the presence of two kind of IgY at 25 ℃ (n=3)

圖5 腐敗希瓦氏菌菌體計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(n=3)Fig.5 Calibration curve forShewanella putrefaciensin NB medium (n=3)

圖6 熒光假單胞菌菌體計(jì)數(shù)曲線(n=3)Fig.6 Calibration curve forPseudomona fluorescensin NB medium (n=3)

2.5 固體培養(yǎng)條件下IgY的抑菌效果

考慮到腐敗希瓦氏菌和假單胞菌屬引起的腐敗常常發(fā)生在肉制品、水產(chǎn)品等固體食品原料中，因此研究IgY抗體在固體培養(yǎng)條件下的抑菌效果將會(huì)更加有效并且有助于其在實(shí)際樣品中的應(yīng)用。固體培養(yǎng)條件下IgY也顯示出了較為顯著的抑菌效果。如表2所示，在固體培養(yǎng)平板上，24h后，經(jīng)過(guò)M1-IgY抗體和M2-IgY抗體處理組與空白對(duì)照組相比對(duì)腐敗希瓦氏菌的抑制率分別為27.8%和38.3%，對(duì)熒光假單胞菌的抑制率分別為31.1%和40.0%。在固體培養(yǎng)條件下兩種混合抗體的抑菌效果基本上與液體培養(yǎng)條件下的抑菌效果保持了很好的一致性。

表2 固體培養(yǎng)基條件下IgY抗體的抑菌效果(n=3)Table 2 Antibacterial effect of mixed IgY in solid NA medium (100mg/ mL) (n=3)

3 結(jié) 論

在4℃冷藏條件下，養(yǎng)殖牙鲆貨架期終點(diǎn)時(shí)的優(yōu)勢(shì)腐敗菌為腐敗希瓦氏菌，所占的比例為58.4%，并且存在水產(chǎn)品中常見(jiàn)的腐敗菌假單胞菌屬細(xì)菌，其中熒光假單胞菌所占的比例最大。將牙鲆貨架期終點(diǎn)時(shí)3種主要的腐敗菌腐敗希瓦氏菌、熒光假單胞菌和腐臭假單胞菌作為混合抗原制備的卵黃抗體，無(wú)論是在液體環(huán)境還是在固體培養(yǎng)條件下，對(duì)水產(chǎn)品中兩種常見(jiàn)的優(yōu)勢(shì)腐敗菌腐敗希瓦氏菌和熒光假單胞菌都具有明顯的抑制趨勢(shì)，這表明其具有非常重要的研究開(kāi)發(fā)價(jià)值，有望作為一種新型的天然生物抑菌劑應(yīng)用于水產(chǎn)食品的抑菌保鮮。通過(guò)卵黃抗體與其他生物抑菌劑的復(fù)合使用，并應(yīng)用于實(shí)際樣品中，增強(qiáng)協(xié)同作用，應(yīng)用前景將很廣闊。

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Characterization of Chicken Egg Yolk Antibodies against Dominant Spoilage Organisms in Paralichthys olivaceus during Cold Storage

XU Ya-fu，LIN Hong，ZHANG Qian，TIAN Liang-liang，ZHAO Shuo，SUI Jian-xin，CAO Li-min* (Food Safety Laboratory, Ocean University of China, Qingdao 266003, China)

The dominant spoilage organisms in cultured Paralichthys olivaceus during cold storage at 4 ℃ were qualitatively and quantitatively investigated. Based on the colony morphology, biochemical and physiological characteristics, spoilage bacteria were isolated at the end of shelf life and identified using bacteria identification systems. Shewanella putrefaciens was dominated spoilage bacteria, which accounted for about 58.4% of all bacteria at the end of shelf life at 4 ℃. Pseudomonas which were common spoilage bacteria in aquatic products included Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas taetrolens and Pseudomonas marginalis，with a corresponding proportion of 63.2%, 29.2% and 7.6%, respectively. Two types of egg yolk antibodies (IgY) against Shewanella putrefaciens, Pseudomonas fluorescens and Pseudomonas taetrolens were obtained by immunizing leghorn chicken by two methods, and their antibacterial efficiencies in liquid and solid media were evaluated. After incubation for 8 h in liquid culture, the inhibition ratio of the two IgYs at 100 mg/mL against antigen bacteria could attain between 61% and 78%, and after incubation for 24 h in solid culture, the inhibition ratio could reached between 27% and 40%. This demonstrates the potential application of egg yolk antibody as a natural antimicrobial agent for preservation and bacteria inhibition.

Paralichthys olivaceus；dominated spoilage organisms；Shewanella putrefaciens；Pseudomonas；Egg yolk immunoglobulin；antimicrobial activity

TS254. 4

A

1002-6630(2010)23-0109-05

2010-09-17

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30972288)；國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)(鲆鰈類)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目(nycytx-50-G09)

胥亞夫(1985—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)樗a(chǎn)品質(zhì)量安全。E-mail：fayalisa@163.com

*通信作者：曹立民(1972—)，男，副教授，博士，研究方向?yàn)樗a(chǎn)品質(zhì)量安全。E-mail：caolimin@ouc.edu.cn