大豆分離蛋白水解物降血壓活性的體外檢測(cè)

孫 旸， 孫春玉， 陳 光*

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118)

大豆分離蛋白水解物降血壓活性的體外檢測(cè)

孫 旸， 孫春玉， 陳 光*

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118)

采用Alcalase酶處理大豆分離蛋白，對(duì)產(chǎn)物及其層析組分的降血壓活性進(jìn)行研究，結(jié)果表明Alcalase酶處理大豆分離蛋白產(chǎn)物具有一定的降血壓活性；通過分子篩層析分離后，所得小分子組分降血壓活性較高；增加外切酶處理可以改善水解產(chǎn)物的口味，但與不加酶處理相比其降血壓活性降低。

大豆分離蛋白；Alcalase蛋白酶；水解；降血壓活性

大豆功能性低聚肽是大豆蛋白經(jīng)蛋白水解酶作用后，再經(jīng)過特殊處理而得到的低肽混合物，具有許多生理功能，如降低膽固醇、抑制血壓升高、增強(qiáng)免疫功能和抗自由基損傷等[1-2]。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(angiotensin converting enzyme，ACE)在人體內(nèi)通過腎素-血管緊張素系統(tǒng)和激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)參與血壓的調(diào)節(jié)：通過ACE作用于血管緊張素Ⅰ，從其C末端去掉His-Leu生成血管緊張素Ⅱ，血管緊張素Ⅱ作用于小動(dòng)脈，使血管平滑肌收縮，從而引起血壓升高。服用ACE的抑制劑可減少血管緊張素Ⅱ的生成，達(dá)到治療高血壓的目的[3-4]。多種人工合成或由蛋白質(zhì)降解得到的短肽都可在一定程度上抑制血管緊張素轉(zhuǎn)移酶的活性起到降血壓的功效[5-7]。大豆肽能抑制ACE活性，而對(duì)正常血壓沒有降壓作用，安全可靠[8]。本實(shí)驗(yàn)采用Alcalase酶解大豆分離蛋白，對(duì)所得的大豆肽及其層析分離組分的降血壓活性進(jìn)行研究，以期提高大豆產(chǎn)品的附加值，為大豆肽作為新一代蛋白營(yíng)養(yǎng)素和多功能保健物質(zhì)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

Alcalase堿性內(nèi)切蛋白酶、Flavourzyme風(fēng)味蛋白酶 丹麥Novo公司；金龜2200大豆分離蛋白 吉林不二蛋白有限公司；考馬斯亮蘭 G-250 Fluka公司；葡聚糖凝膠Sephadex G-50 Pharmacia公司；HHL(Hip-His-Leu)、ACE (兔肺血管緊張素轉(zhuǎn)化酶) Sigma公司。

Agilent 1100型高效液相色譜儀和C18反相色譜柱 美國(guó)Agilent公司；UV-1100型紫外-可見分光光度計(jì) 北京瑞利分析儀器公司；DELTA 320 pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；LG-3型冷凍干燥機(jī) 寧波市生化儀器廠； HD-21-1核酸蛋白檢測(cè)儀、BSZ-100自動(dòng)部分收集器 上海青浦滬西儀器廠；XWT-S小型臺(tái)式記錄儀 上海自動(dòng)化儀表三廠；層析柱(4cm×100cm) 上海錦華層析設(shè)備廠。

1.2 方法

1.2.1 酶活力的測(cè)定

酶活力測(cè)定采用福林酚法[9]。

1.2.2 大豆肽的酶水解

Alcalase酶水解大豆分離蛋白參照文獻(xiàn)[10]中的工藝。

1.2.3 水解度(DH)的測(cè)定

水解度測(cè)定采用pH-Stat法[11]。

1.2.4 水解產(chǎn)物的層析分離

采用G-50葡聚糖凝膠對(duì)混合肽進(jìn)行分子篩層析分離。柱末端與核酸蛋白檢測(cè)儀、記錄儀相聯(lián)，柱參數(shù)為：柱徑4cm、填料高度80cm、檢測(cè)波長(zhǎng)254nm、流速3.5mL/min、加樣量為25mL、室溫下以蒸餾水進(jìn)行洗脫。

1.2.5 分子質(zhì)量分布的測(cè)定

采用SDS-PAGE不連續(xù)電泳[12]方法。

1.2.6 降血壓活性測(cè)定

參照文獻(xiàn)[13]方法。HHL(Hip-His-Leu)與血管緊張素Ⅰ的C末端結(jié)構(gòu)類似，可作為ACE催化反應(yīng)的底物。本實(shí)驗(yàn)中以ACE催化降解HHL，反應(yīng)在40℃恒溫水浴中進(jìn)行，通過高效液相色譜分離并檢驗(yàn)產(chǎn)物馬尿酸的含量。HPLC色譜分析條件為：C18分析型色譜柱；檢測(cè)波長(zhǎng)：228nm；流速：0.5mL/min；上樣量：6μL，自動(dòng)進(jìn)樣；緩沖液A：水(含體積分?jǐn)?shù)為0.05%的冰醋酸)，緩沖液B：乙腈(含體積分?jǐn)?shù)為0.05%的冰醋酸)；梯度洗脫：0～30%(45min)緩沖液B；柱溫：25℃。

ACE受到抑制會(huì)使馬尿酸的產(chǎn)量減少，以馬尿酸產(chǎn)量相對(duì)于空白實(shí)驗(yàn)減少的百分率代表大豆肽及其層析組分的ACE抑制率。

式中：Si為i組分作用下生成馬尿酸的峰面積；S0為空白實(shí)驗(yàn)中生成馬尿酸的峰面積。

2 結(jié)果與分析

2.1 水解度測(cè)定

采用pH-Stat法測(cè)定水解度為22.02%。

2.2 水解混合肽的分離效果

大豆分離蛋白經(jīng)Alcalase堿性蛋白酶水解后，所得到的是各種肽的混合物，根據(jù)分子篩分離原理，采用葡聚糖凝膠G-50對(duì)混合肽進(jìn)行分離，以提取活性組分，圖1為Alcalase酶解產(chǎn)物分離圖譜。

由圖1可知，G-50凝膠可將混合肽按分子質(zhì)量分成5種組分，前3種含量較大，而后兩種較低，5個(gè)峰的分離效果較好。將G-50凝膠分離單酶水解混合肽所得的5種組分分別收集，記為層析組分1～5。各組分濃縮后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，以檢驗(yàn)?zāi)z分離的效果，并確定各組分的分子質(zhì)量，見圖2。

圖1 G-50凝膠對(duì)單酶水解混合肽的分離效果Fig.1 Separation effect of Sephadex G-50 on hydrolysates by a single enzyme

圖2 G-50凝膠分離各組分的電泳圖譜Fig.2 Electrophoresis pattern of all components using Sephadex G-50

由圖2可見，G-50凝膠分離單酶水解混合肽所得5種組分中：層析組分1～3條帶清晰；層析組分4、5經(jīng)濃縮后仍不能顯示清晰的條帶，認(rèn)為是由于此兩種組分的分子質(zhì)量較小已經(jīng)跑出分離膠所致，或是由于在實(shí)驗(yàn)的染色條件不適合小肽的顯色。分別計(jì)算圖2中各組分的遷移率，以分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品的遷移率作遷移率關(guān)于分子質(zhì)量對(duì)數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并求出其回歸方程為y =－1.958x+4.9487。將凝膠分離得到的顯色清晰的3種組分的遷移率代入該方程，計(jì)算其平均分子質(zhì)量分別約為22550、13548、3517u，標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖3。

圖3 G-50凝膠分離單酶水解混合肽所得各組分的分子質(zhì)量Fig.3 Molecular mass of hydrolysates separated by Sephadex G-50

2.3大豆肽的降血壓活性(ACE抑制率)

圖4 空白(無抑制劑)色譜圖Fig.4 Chromatograph of blank sample without inhibitory agents

圖5 Alcalase酶解產(chǎn)物抑制ACE活性效果色譜圖Fig.5 Inhibitory effect of hydrolysates through alcalase hydrolysis on ACE

圖6 層析組分1抑制ACE活性效果色譜圖Fig.6 Inhibitory effect of fractionⅠ on ACE

圖7 層析組分2抑制ACE活性效果色譜圖Fig.7 Inhibitory effect of fraction Ⅱ on ACE

圖8 層析組分3抑制ACE活性效果色譜圖Fig.8 Inhibitory effect of fractionⅢ on ACE

馬尿酸分子質(zhì)量小，保留時(shí)間短而先出峰，其峰面積代表了馬尿酸的產(chǎn)量。與空白實(shí)驗(yàn)相比，添加大豆蛋白的酶解產(chǎn)物及其層析分離組分都能使馬尿酸的產(chǎn)量減少，即對(duì)ACE的活性起到抑制作用。Alcalase酶解產(chǎn)物具有較強(qiáng)的ACE抑制活性，為明確其中的活性組分，又用葡聚糖凝膠色譜對(duì)其進(jìn)行分離，分別進(jìn)行ACE抑制活性研究，結(jié)果見圖4～8。

Alcalase酶解產(chǎn)物對(duì)ACE活性的抑制率達(dá)31.4% (圖5)；層析組分1、2、3對(duì)ACE抑制率分別為7.9%、24.7%和39.7%(圖6～8)，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別達(dá)到總水解物的14.1%、7.8%和62.5%；總體看來ACE抑制活性有隨水解物分子質(zhì)量減小而加強(qiáng)的趨勢(shì)。實(shí)驗(yàn)中采用Flavourzyme風(fēng)味蛋白酶進(jìn)行雙酶作用，經(jīng)雙酶連續(xù)作用后大豆蛋白水解產(chǎn)物的苦味明顯減少，但經(jīng)檢測(cè)，其ACE抑制率僅有12.5%，尚不足單酶水解產(chǎn)物的一半。分析可能的原因?yàn)锳CE屬于外切酶，其抑制劑的C端結(jié)構(gòu)對(duì)抑制活性影響較大，而Flavourzyme風(fēng)味蛋白酶具有外切酶活性，破壞了抑制劑的C端的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致活性的下降[14-16]。

3 結(jié) 論

對(duì)Alcalase酶處理大豆分離蛋白產(chǎn)物及其層析組分的降血壓活性進(jìn)行研究，結(jié)果表明Alcalase酶水解大豆分離蛋白產(chǎn)物具有一定的降血壓效果，其ACE活性抑制率達(dá)31.4%；Alcalase酶水解大豆分離蛋白產(chǎn)物抑制ACE活性有隨水解物分子質(zhì)量減小而加強(qiáng)的趨勢(shì)；引入外切酶作用可能會(huì)破壞Alcalase酶水解大豆分離蛋白產(chǎn)物中抑制ACE活性成分結(jié)構(gòu)。

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in vitro Hypotensive Effect of Hydrolyzed Soybean Protein

SUN Yang，SUN Chun-yu，CHEN Guang*
(College of Life Sciences, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China)

Soybean protein hydrolysates were prepared by enzymatic hydrolysis with alcalase. Inhibitory activities of enzymatic hydrolysates and the purification fractions to angiotensin I converting enzyme (ACE) were determined for evaluating their hypotensive effects. Results showed that both enzymatic hydrolysates and purified fractions with smaller molecular weights exhibited higher hypotensive activity. However, exonuclease treatment could result in the improvement of flavor and reduction of hypotensive activity for hydrolysates.

soybean protein；alcalase；hydrolysis；hypotensive effect

R151.2

A

1002-6630(2010)09-0272-04

2009-10-13

吉林省科技發(fā)展重點(diǎn)項(xiàng)目(20070207)

孫旸(1976—)，男，講師，博士研究生，研究方向?yàn)槊腹こ?。E-mail：robsuny@163.com

*通信作者：陳光(1961—)，女，教授，博士，研究方向?yàn)槊腹こ?。E-mail：chg61@163.com