黃傘子實體多糖的初步純化及降血脂研究

李德海，王志強(qiáng)，孫常雁，王 萍,*

(1.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江省乳品工業(yè)技術(shù)開發(fā)中心，黑龍江 哈爾濱 150086)

黃傘子實體多糖的初步純化及降血脂研究

李德海1，王志強(qiáng)1，孫常雁2，王 萍1,*

(1.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江省乳品工業(yè)技術(shù)開發(fā)中心，黑龍江 哈爾濱 150086)

目的：探討黃傘子實體多糖的純化方法及對高脂血癥小鼠降血脂作用。方法：子實體多糖經(jīng)中性蛋白酶和Sevag法聯(lián)合除蛋白，用高脂飼料建立高脂血癥模型，給藥高、中、低劑量組分別為400、200、100mg/(kg bw·d)，5周后測定小鼠血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)。結(jié)果：黃傘子實體多糖能顯著降低TC(高、低劑量組P＜0.05)、TG(中劑量組P＜0.05，低、高劑量組P＜0.01)、LDL-C(中、高劑量組P＜0.05，低劑量組P＜0.01)水平，提高HDL-C水平(低、高劑量組P＜0.05，中劑量組P＜0.01)和動脈粥樣硬化因子(AI)(高劑量組P＜0.05)。結(jié)論：黃傘子實體多糖具有降低小鼠高血脂癥、預(yù)防動脈粥樣硬化的作用。

黃傘；多糖；高脂血癥；降血脂；小鼠

高血壓、動脈粥樣硬化以及冠心病是常見的心血管疾病，血脂升高是形成動脈粥樣硬化的危險因素之一。因此降低血脂含量對預(yù)防高血壓、冠心病等心血管疾病具有重要意義。研究表明，食用菌多糖中某些成分可以降低血栓物質(zhì)的形成；一些食用菌多糖中含有特種氨基酸，可幫助脂類物質(zhì)的降解[1]。

黃傘(Pholiota adipose (Fr) Quel)屬真菌門、擔(dān)子菌綱，又名肥鱗傘、柳蘑等[2]。黃傘色澤金黃，營養(yǎng)豐富，子實體中粗蛋白、粗纖維和灰分的含量與一般食用菌的含量相當(dāng)，粗脂肪含量低于一般食用菌，多糖含量為4.11%，高于一般食用菌[3]。許多研究證明其多糖具有抗腫瘤、抗疲勞、抗微生物活性等生物理能[4-6]，

因此引起了人們越來越多的關(guān)注。

黃傘營養(yǎng)保健價值高，但國內(nèi)對黃傘的研究起步較晚，且主要停留在對黃傘的野生馴化、生物學(xué)特性及人工栽培技術(shù)等方面[7-9]。目前關(guān)于黃傘多糖生物活性的研究很少，關(guān)于應(yīng)用黃傘子實體多糖降血脂功能的研究還未見報道，本研究通過高脂飼料建立小鼠高脂血脂模型，探討黃傘子實體多糖的降血脂作用，為進(jìn)一步研究多糖降血脂作用機(jī)理提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃傘子實體由東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院森林保護(hù)專業(yè)實驗室提供。

年幼純系昆明種小鼠(由黑龍江省醫(yī)學(xué)實驗動物基地提供)，雄性，體質(zhì)量(20±2)g；基礎(chǔ)飼料由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)提供。

豬油 自制；膽固醇 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；豬膽鹽 天津虔誠偉業(yè)科技發(fā)展有限公司；血清總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C) 溫州東歐津瑪生物科技有限公司；甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C) 北京北化康泰臨床試劑有限公司。1.2儀器與設(shè)備

TU-1810紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；CHRIST 1-2真空泠凍干燥機(jī) 德國Christ公司；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；LD4-2A低速離心機(jī) 北京醫(yī)用離心機(jī)廠。

1.3 方法

1.3.1 黃傘子實體多糖的提取

黃傘子實體經(jīng)粉碎過60目篩，醇沉過夜除去小分子多糖。在料液比1∶20、提取時間2h、提取溫度90℃的條件下提取黃傘子實體多糖提取液[10]，殘渣在上述條件下進(jìn)行第2次提取，合并兩次提取液，在60℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至原體積的1/4，濃縮后冷卻至室溫，加入3倍體積的90%乙醇溶液，醇沉過夜。于4000r/min離心10min，棄去上清液。沉淀物經(jīng)凍干得黃傘粗多糖。

1.3.2 黃傘子實體粗多糖的初步純化

1.3.2.1 Sevag法

取黃傘粗多糖2g溶于盡量少的蒸餾水中，與氯仿-正丁醇(4∶1)等體積混合并充分?jǐn)嚢?0min，除去游離蛋白質(zhì)。醇沉過夜，離心，用有機(jī)溶劑洗滌沉淀，洗滌順序：丙酮、乙醚、無水乙醇。沉淀凍干得黃傘子實體多糖，采用苯酚-硫酸法測定多糖含量。

1.3.2.2 中性蛋白酶+Sevag法

取黃傘粗多糖2g溶于盡量少的蒸餾水中，按黃傘多糖質(zhì)量的2%加入中性蛋白酶[11]，在50℃、pH7.0的條件下酶解2h，然后在80℃滅酶10min。其余步驟同1.3.2.1節(jié)。

1.3.3 高血脂癥的建立

小鼠除空白組外其余以高脂飼料(豬油體積分?jǐn)?shù)10%、膽固醇體積分?jǐn)?shù)1%、豬膽鹽體積分?jǐn)?shù)0.3%、基礎(chǔ)飼料體積分?jǐn)?shù)88.7%)喂養(yǎng)誘導(dǎo)高血脂癥的形成。3周后，隨機(jī)從空白組和高脂組選取3只，摘眼球取血測定TC水平，以確定高脂模型的建立[12-14]。

1.3.4 降血脂實驗

將已建立高血脂癥的小鼠隨機(jī)分為模型組、高劑量組、中劑量組、低劑量組，每組1 0只，除空白組外其余各組飼喂高脂飼料，自由進(jìn)食。各組給藥劑量分別為：高劑量組(400mg/(kg b w·d))；中劑量組(200mg/(kg bw·d))；低劑量組(100mg/(kg bw·d))；空白組和模型組灌胃相等劑量的生理鹽水。5周后禁食24h，摘眼球取血清測定TC、TG、HDL-C、LDL-C、血清抗動脈粥樣因子AI(HDL-C/TC)水平[15]。

1.3.5 統(tǒng)計分析

利用SPSS統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，顯著性水平確定為0.05，極顯著性水平確定為0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃傘子實體多糖的初步純化

黃傘粗多糖經(jīng)過Sevag法除蛋白后多糖純度為28.17%，而中性蛋白酶與Sevag法聯(lián)合除蛋白得到的多糖純度為72.88%，比僅用Sevag法提高44.71%。在純化過程中，蛋白酶對黃傘子實體中的蛋白以及與多糖結(jié)合的蛋白進(jìn)行水解，使多糖游離出來，同時蛋白被降解，增加了蛋白質(zhì)的溶解性，從而有利于多糖和蛋白的分離，因此提高了多糖的純度。

2.2 高脂模型組的建立

用高脂飼料喂養(yǎng)小鼠3周，測得小鼠體質(zhì)量與TC變化。

表1 小鼠體質(zhì)量和總膽固醇濃度變化Table 1 Changes in body weight and total cholesterol of mice

由表1可知，小鼠喂養(yǎng)3周后，小鼠體質(zhì)量發(fā)生極顯著性變化(P＜0.01)，3周后模型組小鼠體質(zhì)量比空

白組小鼠體質(zhì)量高出30%；小鼠血清總膽固醇含量極顯著升高(P＜0.01)，升高率為82.2%，表明已建立高脂血癥小鼠模型。本實驗通過飼喂高脂飼料的方法建立高脂血癥小鼠模型，其原理是膽固醇在代謝中產(chǎn)生膽酸，并參與脂肪的消化吸收，而豬膽鹽能促進(jìn)膽固醇在體內(nèi)的代謝，從而加速高血脂癥的形成

2.3 黃傘子實體多糖對小鼠體質(zhì)量的影響

條碼掃描儀：接收控制中心指令，同時掃描保護(hù)裝置機(jī)箱條碼并傳遞給控制中心。本系統(tǒng)采用左右兩個工裝臺進(jìn)行交替式測試，智能測試控制中心根據(jù)掃描儀的ID號進(jìn)行左右測試子系統(tǒng)的識別與控制。

表 2 黃傘子實體多糖對小鼠體質(zhì)量的影響Table 2 Effect ofPholiota adiposepolysaccharides on body weight of mice

由表2可知，隨著實驗時間的延長，各組小鼠體質(zhì)量的增幅分別為空白組32.2%、模型組37.6%、低劑量39.3%、中劑量38.9%、高劑量33.8%，組間增幅無顯著性變化(P＞0.05)。每周稱量1次，以確定繼續(xù)灌胃劑量，從表2可以看出各組小鼠生長良好。

2.4 黃傘子實體多糖對小鼠血脂的影響

2.4.1 黃傘子實體多糖對小鼠總膽固醇的影響

由表3可知，黃傘子實體多糖低劑量組和高劑量組有顯著降低高血脂小鼠血清總膽固醇的作用(P＜0.05)。灌胃不同劑量的黃傘子實體多糖5周后，與空白組相比，模型組血清總膽固醇含量有極顯著性升高(P＜0.01)，表明模型建立成功；灌胃黃傘子實體多糖后，小鼠TC的降幅為7.3%～15.1%，與模型組相比，低劑量組和高劑量組降幅明顯(P＜0.05)，中劑量組無顯著性變化(P＞0.05)，分析原因可能是，黃傘子實體多糖只有在一定劑量范圍內(nèi)才能發(fā)揮降脂作用，高于或低于某一劑量范圍，均有顯著作用。

2.4.2 黃傘子實體多糖對小鼠甘油三酯的影響

由表3可知，黃傘子實體多糖有顯著降低小鼠甘油三酯的作用。飼喂5周后，模型組甘油三酯水平高于空白組54.5%，發(fā)生極顯著性變化(P＜0.01)，表明模型建立成功；灌胃黃傘子實體多糖5周后，各給藥組小鼠TG降幅為26.4%～45.8%，與模型組相比，低劑量組和高劑量組發(fā)生極顯著性降低(P＜0.01)，中劑量組顯著性降低(P＜0.05)，分析原因可能是，黃傘子實體多糖只有在一定劑量范圍內(nèi)才能發(fā)揮降脂作用，高于或低于某一劑量范圍，均有明顯作用。

2.4.3 黃傘子實體多糖對小鼠高密度脂蛋白膽固醇的影響

由表3可知，黃傘子實體多糖有顯著提高小鼠高密度脂蛋白膽固醇的作用。飼喂5周后，模型組高密度脂蛋白膽固醇水平低于空白組34.9%，發(fā)生顯著性變化(P＜0.05)，表明模型建立成功；灌胃黃傘子實體多糖5周后，各給藥組小鼠HDL-C增幅為27.4%～55.8%，與模型組相比，低劑量組和高劑量組增幅發(fā)生顯著性變化(P＜0.05)，中劑量組增幅最為明顯為55.8%，發(fā)生極顯著性變化(P＜0.01)。分析原因可能是，黃傘子實體多糖的最佳作用效果受含量的影響，當(dāng)高于或低于某一劑量時作用效果不明顯，只有在合適的范圍才能發(fā)揮最佳的降脂效果。

2.4.4 黃傘子實體多糖對小鼠低密度脂蛋白膽固醇的影響

由表3可知，黃傘子實體多糖有顯著降低小鼠低密度脂蛋白膽固醇的作用。飼喂5周后，模型組低密度脂蛋白膽固醇水平高于空白組98.2%，升幅極顯著(P＜0.01)，表明模型建立成功；灌胃黃傘子實體多糖后，各給藥組LDL-C降幅為33.1%～49.5%，與模型組相比，中劑量組和高劑量組降幅顯著(P＜0.05)，低劑量組降幅極顯著(P＜0.01)。分析原因可能是，當(dāng)黃傘子實體多糖超過一定劑量時，作用效果變得不明顯。

2.4.5 黃傘子實體多糖對小鼠血清抗動脈粥樣因子的影響

表 3 黃傘子實體多糖對TC、TG、HDL-C、LDL-C、AI的影響Table 3 Effect ofPholiota adiposepolysaccharides on serum TC, TG, HDL-C, LDL-C and AI levels of mice

由表3可知，黃傘子實體多糖對防止血清動脈粥樣硬化具有一定的預(yù)防作用。飼喂5周后，模型組血清抗

動脈粥樣因子低于空白組65.0%，發(fā)生極顯著性降低(P＜0.01)，表明模型建立成功；5周后，與模型組相比，各給藥組均能不同程度的提高血清抗動脈粥樣因子的水平，低劑量組和中劑量組無顯著性變化，高劑量組有顯著性提高(P＜0.05)，血清抗動脈粥樣因子與黃傘子實體多糖成一定的線性關(guān)系。

3 結(jié) 論

本實驗比較了Sevag法和酶+Sevag聯(lián)合法除蛋白的方法，后者的除蛋白效率明顯高于前者，多糖含量為72.88%，Sevag法多糖含量為28.17%，比僅用Sevag法提高了44.71%。可見，在多糖純化過程中使用蛋白酶除蛋白是非常有效的方法。

血清總膽固醇和甘油三酯的含量是高血脂癥的重要指標(biāo)，而HDL-C/TC的比值更能很好的反映動脈粥樣硬化和冠心病的發(fā)病率，比單一指標(biāo)更為靈敏。經(jīng)過動物實驗研究表明，黃傘子實體多糖能顯著降低高血脂癥小鼠的TC、TG和LDL-C水平，提高HDL-C水平和AI，對高血脂癥的發(fā)生有一定的預(yù)防作用。但是關(guān)于黃傘子實體多糖的進(jìn)一步分離純化，結(jié)構(gòu)鑒定，量效關(guān)系和降脂機(jī)理還需要進(jìn)一步的研究。

[1]周國華, 于國萍. 黑木耳多糖降血脂作用的研究[J]. 現(xiàn)代食品科技, 2005(1)∶ 46-47.

[2]王生存. 黃傘研究現(xiàn)狀及開發(fā)利用前景展望[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科技, 2007 (22)∶ 6755-6755.

[3]惠豐立, 魏明卉, 劉征. 黃傘子實體營養(yǎng)成分分析[J]. 食用菌學(xué)報, 2003(4)∶ 20-23.

[4]蔣曉琴, 丁曉明, 劉海燕, 等. 黃傘粗多糖抗腫瘤及對荷瘤小鼠免疫功能影響的研究[J]. 中國藥師, 2007(2)∶ 119-120.

[5]黃清榮, 辛?xí)粤? 鐘旭生, 等. 黃傘菌絲體多糖提取及其抗疲勞活性的研究[J]. 食品研究與開發(fā), 2005, 26(6)∶ 6-9.

[6]DULGER B. Antimicrobial activity of the macrofungus Pholiota adipose [J]. Fitoterapia, 2004, 75(3/4)∶ 396-397.

[7]馬鳳, 張?zhí)烀? 昌明, 等. 黑龍江省珍稀野生黃傘馴化栽培技術(shù)的研究[J]. 中國林副特產(chǎn), 2006(5)∶ 33-34.

[8]劉靖宇, 孟俊龍, 常明昌. 黃傘菌絲體生物學(xué)特性的研究[J]. 中國食用菌, 2006(2)∶ 24-27.

[9]丁湖廣. 珍稀菇黃傘的特性及栽培[J]. 云南農(nóng)業(yè)科技, 2001(5)∶34-35.

[10]全艷玲, 解生權(quán), 龐清海, 等. 黃傘多糖提取優(yōu)化[J]. 中國釀造, 2008 (14)∶ 68-68.

[11]DEMIDYUK I V, KALASHNIKOV A E, GROMOVA T Y, et al. Cloning, sequencing, expression, and characterization of protealysin, a novel neutral proteinase from Serratia proteamaculans representing a new group of thermolysin-like proteases with short N-terminal region of precursor[J]. Protein Expression and Purification, 2006, 47(2)∶ 553-554.

[12]劉小美, 方肇勤, 潘志強(qiáng), 等. 不同高脂飼料致高脂血癥大鼠模型的比較及評價[J]. 陜西中醫(yī), 2008, 29(12)∶ 1680-1682.

[13]WOO M N, BOK S H, CHOI M S, et al. Hypolipidemic and body fatlowering effects of Fatclean in rats fed a high-fat diet[J]. Food and Chemical Toxicology, 2009, 47(8)∶ 2076-2081.

[14]HOU Yan, SHAO Wanfang, XIAO Rong, et al. Pu-erh tea aqueous extracts lower atherosclerotic risk factors in a rat hyperlipidemia model [J]. Experimental Gerontology, 2009, 44∶ 434-439.

[15]韋璐, 秦小明, 林華娟, 等. 金花茶多糖的降血脂功能研究[J]. 食品科技, 2008(3)∶ 247-249.

Purification and Hypolipidemic Effect of Polysaccharides from Fruit Body of Pholiota adipose

LI De-hai1，WANG Zhi-qiang1，SUN Chang-yan2，WANG Ping1,*
(1. School of Forestry, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China；2. Heilongjiang Dairy Industry Technical Development Center, Harbin 150086, China)

Objective∶ To explore the purification method and hypolipidemic effect of polysaccharides from fruit body of Pholiota adipose polysaccharides. Methods∶ The crude polysaccharides were purified after removing protein by neutral protease and Sevag method. Experimental mice were divided into five groups including NS control group, the model group with high fat diet, the treatment groups fed with purified polysaccharides at the low-dosage of 100 mg/(kg bw·d), the medium-dosage of 200 mg/(kg bw·d) and the high-dosage of 400 mg/(kg bw·d). Due to the high fat diet, the model of hyperlipidemia was successfully established. After five weeks, the contents of serum TC, TG, high-density cholesterol (HDL-C), low-density cholesterol (LDL-C) were determined. Results∶ Purified polysaccharides from Pholiota adipose at three dosages exhibited the significant decrease in TC (high-dosage group and low-dosage group P＜0.05), TG (medium-dosage group P＜0.05, high-dosage group and low-dosage group P＜0.01), LDL-C (medium-dosage group and high-dosage group P＜0.05, low-dosage group P＜0.01), the significant improvement in HDL-C (high-dosage group and low-dosage group P＜0.05，medium-dosgage group P＜0.01) and arteriosclerosis factor (AI) (high-dosage group P＜0.05). Conclusion∶ Polysaccharides from Pholiota adipose play an important role in the reduction of blood lipid and prevention of arteriosclerosis in mice.

Pholiota adipose；polysaccharides；hypolipidemia；hypolipidemic effect；mice

TQ929.2

A

1002-6630(2010)09-0268-04

2009-09-18

李德海(1976—)，男，講師，碩士，主要從事食品化學(xué)及植物活性成分研究。E-mail：lidehaineau@163.com

*通信作者：王萍(1964—)，女，教授，博士，主要從事食品化學(xué)及植物活性成分研究。 E-mail：wangpingwobs@163.com