影響超氧化物歧化酶活性測定的因素

趙 建，李 想，魯 政，文 鏡,*

(1.北京聯(lián)合大學(xué) 生物活性物質(zhì)與功能食品北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100191；2.北京市藥品檢驗(yàn)所，北京 100035)

影響超氧化物歧化酶活性測定的因素

趙 建1，李 想2，魯 政1，文 鏡1,*

(1.北京聯(lián)合大學(xué) 生物活性物質(zhì)與功能食品北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100191；2.北京市藥品檢驗(yàn)所，北京 100035)

目的：證實(shí)在黃嘌呤氧化酶法中影響超氧化物歧化酶(SOD)活性測定的干擾因素及其對保健食品抗氧化功能評價造成誤差。方法：用黃嘌呤氧化酶法測定加入白蛋白、總蛋白、甘油三酯、葡萄糖、VC、還原型谷胱甘肽6種物質(zhì)對SOD檢測體系的影響以及小鼠灌胃VC后的SOD比活力值。結(jié)果：在黃嘌呤氧化酶法反應(yīng)體系中，SOD 滅活后依然能夠檢測到SOD比活力值。白蛋白、總蛋白、甘油三酯、葡萄糖、VC、還原型谷胱甘肽6種物質(zhì)都對該體系造成干擾。透析能夠消除小鼠血清中小分子物質(zhì)的干擾。結(jié)論：由于黃嘌呤氧化酶法檢測SOD為非特異性反應(yīng)，血清中的蛋白質(zhì)、脂肪、VC、還原型谷胱甘肽等物質(zhì)都對SOD 活性測定產(chǎn)生干擾而造成正誤差?？刹捎猛肝龅姆椒ㄈコ逯泻袑OD檢測體系構(gòu)成干擾的小分子物質(zhì)。

抗氧化保健食品；功能評價；超氧化物歧化酶；檢測方法

超氧化物歧化酶(SOD)是一種廣泛存在于生物體內(nèi)的金屬酶，它是重要的氧自由基清除劑，能特異地清除超氧陰離子自由基，抑制超氧自由基的氧化作用，因而具有抗氧化、防動脈粥樣硬化、抗腫瘤、抗幅射等功能[1]。目前SOD活性的檢測指標(biāo)被應(yīng)用在保健食品抗氧化和對輻射危害有輔助保護(hù)功能的功能評價當(dāng)中[2]。測定SOD活性方法有很多，如黃嘌呤氧化酶法、簡易凝膠擴(kuò)散法、鄰苯三酚自氧化法、化學(xué)發(fā)光法、熒光動力學(xué)法和酶聯(lián)免疫法等[3-7]。目前我國保健食品功能評價標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定了SOD活性檢測采用黃嘌呤氧化酶法[2]。由于該方法的非特異性，在應(yīng)用中如果不對樣品進(jìn)行選擇或進(jìn)行必要的前處理，樣品中的雜質(zhì)會給測定結(jié)果帶來很大誤差。本實(shí)驗(yàn)研究黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性時可能存在的干擾因素，旨在為準(zhǔn)確測定酶活性提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選用中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物研究所繁育場[許可證號：SCXK(京)2004-0001]繁殖的昆明種25～28g健康清潔級雌性小鼠25只。實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)于北京聯(lián)合大學(xué)應(yīng)用文理學(xué)院保健食品檢測中心SPF級動物室，實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號：SYXK(京)2007-0020。

鹽酸羥胺 北京化工廠；黃嘌呤、黃嘌呤氧化酶、對氨基苯磺酸、甲萘胺 北京北方偉業(yè)發(fā)展有限公司；VC 廣東西隴化工廠；還原型谷胱甘肽 上海麗珠東風(fēng)生物技術(shù)有限公司；SOD標(biāo)準(zhǔn)品(6000U/mg) 北京Biodee 生物有限公司；總蛋白校準(zhǔn)液(7.0g/100mL)、白蛋白校準(zhǔn)液(4.0g/100mL)、甘油三脂校準(zhǔn)液(2.26mmol/L)、葡萄糖校準(zhǔn)液(5.55mmol/L) 中生北控生物科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV2450可見-紫外分光光度計 日本島津公司；DS電熱恒溫水浴鍋 北京市醫(yī)療設(shè)備廠；BP211D賽多利斯電子天平(精度0.00001g) 賽多利斯公司；透析袋(型號：D27，孔徑：12000～14000D) 上?？蠌?qiáng)儀器有限公司；超純水系統(tǒng)(PALL PURELAB Plus-Pr015XXM/ PL5123) PALL公司；微量移液器 Eppendorf 公司。1.3方法

1.3.1 SOD比活力的測定

將一定量樣品加入含有 pH7.8的1/15mol/L磷酸緩沖液1.0mL的測定管中，然后依次加入10mmol/L鹽酸羥胺0.1mL，7.5mmol/L黃嘌呤0.2mL，0.2mg/mL黃嘌呤氧化酶0.2mL，雙蒸水0.49mL，用漩渦混勻器充分混勻，置37℃恒溫水浴30min后，再加入0.33%對氨基苯磺酸2.0mL，0.1%甲萘胺2.0mL，混勻15min，倒入1cm比色杯，蒸餾水調(diào)零，530nm波長處比色測定吸光度。實(shí)驗(yàn)同時設(shè)一對照管，用等量蒸餾水代替樣品，其他操作同測定管中的實(shí)驗(yàn)步驟。SOD比活力(每毫升反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50%時所對應(yīng)的SOD量為一個SOD活力單位(U))的計算如下式：

式中：A0為對照管吸光度；A1為測定管吸光度；V0為反應(yīng)液體積；V1為所取樣品體積；n為樣品測定前的稀釋倍數(shù)。

1.3.2 SOD加熱滅活實(shí)驗(yàn)

1.3.2.1 血清加熱實(shí)驗(yàn)

取5只小鼠血清，并將每只小鼠血清分為加熱血清與不加熱血清。其中加熱血清分別放置于5支試管中沸水浴加熱5min，使血清中的酶全部失活，然后取加熱后的血清20μL，分別加入到SOD檢測體系中進(jìn)行測定。未加熱的血清分別取20μL加入到SOD檢測體系中與加熱血清平行測定。

1.3.2.2 標(biāo)準(zhǔn)SOD加熱實(shí)驗(yàn)

將質(zhì)量濃度為1μg/mL和2μg/mL的SOD標(biāo)準(zhǔn)溶液沸水浴中加熱5min，使酶全部失活，然后分別取滅活的SOD 30μL，加入到SOD檢測體系中進(jìn)行測定。

1.3.3 血清中干擾物質(zhì)對SOD檢測體系的影響

選擇白蛋白、總蛋白、甘油三酯、葡萄糖、VC、還原型谷胱甘肽6種存在于血清中并可能對SOD檢測體系構(gòu)成干擾的物質(zhì)，分別取樣將其加入到SOD檢測體系中，觀察其對SOD檢測體系的干擾情況。

1.3.4 透析對灌胃VC干擾的排除

將20只小鼠分為VC組和對照組，每組10只。VC組每只小鼠灌胃10mmol/L的VC 0.5mL，對照組每只小鼠灌胃0.5mL蒸餾水，0.5h后眼眶取血，靜置5min后離心，將離心后血清分為對照組透析血清、對照組未透析血清、VC組透析血清和VC組未透析血清，透析血清加入到截留分子量為12000～14000D的透析袋中，用去離子水在4℃條件下透析3h，透析后測定SOD比活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 SOD加熱滅活實(shí)驗(yàn)

2.1.1 血清加熱實(shí)驗(yàn)

表1 加熱血清與正常血清SOD比活力比較 (x±s)Table 1 Comparison of SOD specific activity between heated serum and normal serum (x±s)

由表1可知，加熱血清后，血清中的酶全部失活，但仍能測出SOD比活力，說明血清中除SOD外還存在其他對黃嘌呤氧化酶反應(yīng)體系產(chǎn)生反應(yīng)的物質(zhì)。這些物質(zhì)對SOD的測定會造成干擾。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)SOD加熱實(shí)驗(yàn)

表2 標(biāo)準(zhǔn)SOD加熱失活后所測出的SOD比活力Table 2 Specific activity of standard SOD with heating inactivation

由表2可知，標(biāo)準(zhǔn)SOD加熱失活后，依然能夠檢

測出SOD比活力，且大小與質(zhì)量濃度呈現(xiàn)正相關(guān)。說明即使失活的SOD蛋白對檢測體系也會造成干擾。

2.26 種干擾物質(zhì)對SOD檢測體系的影響

表3 6種干擾物質(zhì)對SOD檢測體系的影響Table 3 Effects of interference substances on SOD detection system

6種干擾物質(zhì)的質(zhì)量濃度是按照文獻(xiàn)[8]中關(guān)于人血清相關(guān)營養(yǎng)素的含量制定的。表3顯示，6種物質(zhì)加入到黃嘌呤氧化酶反應(yīng)體系中均能測出SOD比活力。在6種干擾物質(zhì)中，白蛋白和總蛋白SOD比活力最高。

2.3 透析對SOD比活力測定時VC干擾的排除

表4 透析與未透析對灌胃VC組和對照組小鼠SOD比活力測定的影響Table 4 Effects of dialyzed and non-dialyzed vitamin C samples on SOD specific activity in mice treated with gastric perfusion of vitamin C and the control

從表4可知，對照組血清透析后血清中SOD比活力比未透析下降了10%。透析除去了血清中的小分子物質(zhì)，而將SOD等大分子物質(zhì)保留下來。結(jié)果說明血清中含有對SOD檢測體系構(gòu)成干擾的小分子物質(zhì)，采用透析的方法可以去除這些小分子干擾物質(zhì)。灌胃VC組未透析血清SOD比活力與對照組未透析比較，其小鼠血清SOD比活力提高了8.3%。結(jié)果說明一次性灌胃VC后能夠使血清SOD比活力測定值升高。由于VC只是在取血前0.5h一次性灌胃，在這樣短的時間里不可能對SOD的增加產(chǎn)生影響，因此SOD比活力提高是由于血清中VC含量增加，直接作用于黃嘌呤氧化酶反應(yīng)體系中產(chǎn)生的自由基而所造成的一種假象。通過對灌VC后的血清進(jìn)行透析，干擾被清除。血清經(jīng)過透析將VC和其他一些小分子物質(zhì)排除后，與對照組透析的血清SOD比活力比較，差別不明顯，說明用透析的方法可以排除由于灌胃VC給SOD檢測帶來的干擾。

3 討 論

從黃嘌呤氧化酶法測定樣品中SOD比活力的實(shí)驗(yàn)原理中可以看到，除SOD之外只要反應(yīng)體系中加入能夠與超氧陰離子自由基發(fā)生反應(yīng)的分子，都會對最終的顏色變化造成影響。這就意味著當(dāng)樣品中除SOD之外還有能與超氧陰離子自由基發(fā)生反應(yīng)的物質(zhì)就會對結(jié)果造成干擾。

通過血清加熱實(shí)驗(yàn)證實(shí)了當(dāng)血清中的酶滅活后，在此反應(yīng)體系中依然測出了SOD比活力，顯然這一結(jié)果是由于血清中其他干擾成份造成的。

標(biāo)準(zhǔn)SOD加熱實(shí)驗(yàn)的結(jié)果說明即便是純SOD，當(dāng)加熱使其失活后，仍然能夠在此反應(yīng)體系中測出SOD比活力值。顯然這是一部分超氧陰離子自由基與變性蛋白反應(yīng)造成的 。

為了進(jìn)一步評價血清中其他物質(zhì)對SOD活性測定的影響，本實(shí)驗(yàn)依據(jù)文獻(xiàn)[8]中表述的血清中6種常見物質(zhì)的含量，分別用黃嘌呤氧化酶法對其進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)均能測出SOD比活力。其中蛋白質(zhì)的干擾最大，可能與其在血清中的質(zhì)量濃度較高和蛋白質(zhì)本身帶有的一些化學(xué)基團(tuán)更容易與超氧陰離子自由基反應(yīng)有關(guān)。

目前我國保健食品功能檢測的部頒標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定使用黃嘌呤氧化酶法檢測動物血清或組織中SOD比活力，由于方法中未對樣品進(jìn)行充分的前處理，因此其檢測結(jié)果會有較大誤差。但保健食品功能檢測是一種比較法，即將攝食與未攝食保健食品的動物進(jìn)行比較。由于除保健食品的攝入外，兩組動物在來源，飲食及飼養(yǎng)環(huán)境等各方面條件基本一致，因此兩組動物的SOD比活力測定干擾成份引起的誤差相差不大，將兩組結(jié)果進(jìn)行比較，保健食品的功能還是能夠被反映出來。只不過測定出的SOD比活力與真實(shí)值的差距較大，且為正誤差。

盡管目前的實(shí)驗(yàn)方法能夠?qū)⒂行岣逽OD比活力的保健食品與對照組區(qū)別出來。但是由于這種檢測方法的非特異性，為保健食品的造假帶來可乘之機(jī)。從表4可以看到，只是在取血前30min一次性給小鼠灌胃VC，就能使SOD比活力比對照組提高8.3%，顯然這是由于血清中VC含量增加給SOD檢測帶來的正誤差而所造成的一種假象。如果抗氧化保健食品造假摻入了小分子的化合物，采用透析是解決這個問題的一種方法。

[1]桂興芬, 楊萍, 劉雋, 等. 飲品中超氧化物歧化酶的活性及影響因素[J]. 鄭州工程學(xué)院學(xué)報, 2000, 21(4)∶ 67- 68.

[2]保健食品檢驗(yàn)與評價技術(shù)規(guī)范[S]. 2003.

[3]李革新, 鄭全美. 三種SOD測定方法的比較[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志, 1999, 6(5)∶ 273-274.

[4]楊磊, 陳冠華, 崔建超, 等. 熒光動力學(xué)法測定超氧化物歧化酶的活性[J]. 分析化學(xué)研究報告, 2008, 36(4)∶ 489-493.

[5]儲海虹, 吳瑩, 狄俊偉, 等.電化學(xué)發(fā)光淬滅法測定SOD[J]. 分析測試學(xué)報, 2006, 25(1)∶ 125-126.

[6]廖展如, 陳文學(xué), 艾常春, 等. 鄰苯三酚自氧化法適于測定SOD活性嗎？[J]. 華中師范大學(xué)學(xué)報∶ 自然科學(xué)版, 2003, 37(1)∶ 59-63.

[7]傅崇崗, 楊冬芝. 電泳中介微分析法測定超氧化物歧化酶[J]. 分析化學(xué)研究簡報, 2006, 34(4)∶ 517-520.

[8]何志謙. 人類營養(yǎng)學(xué)[M]. 北京∶ 人民衛(wèi)生出版社, 2000.

Factors Affecting the Determination of Superoxide Dismutase Activity

ZHAO Jian1，LI Xiang2，LU Zheng1，WEN Jing1,*
(1. Beijing Key Laboratory of Bioactive Substances and Functional Foods, Beijing Union University, Beijing 100191, China；2. Beijing Institute for Drug Control , Beijing 100035, China)

Objective∶ To verify the factors for affecting the determination of superoxide disutase (SOD) activity in xanthine oxidase method and the evaluation error for antioxidant functions of healthy food. Methods∶ Effects of the addition of albumin, total protein, triglyceride, glucose, vitamin C and glutathione on SOD determination in xanthine oxidase method and on specific activity of SOD in mice treated with vitamin C through gastric perfusion. Results∶ In xanthine oxidase method, the specific activity of SOD still could be detected although SOD was inactivated. The addition of above six substances could disturb determination results of SOD activity. However, dialysis could eliminate the interference from small molecular substances in serum. Conclusion∶ Xanthine oxidase method for detecting SOD activity is a non-specific method. Protein, fat, vitamin C and glutathione in serum can affect SOD activity to result in a positive error. Dialysis is a simple and effective method to remove these interference substances.

antioxidant healthy food；functional evaluation；superoxide dismutase；detection method

TS207.3

A

1002-6630(2010)09-0216-03

2009-07-16

北京市教委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室引導(dǎo)基金項目(21202543503)

趙建(1972—)，男，工程師，本科，主要從事保健食品功能評價研究。E-mail：zhaojian@ygi.edu.cn

*通信作者：文鏡(1952—)，男，教授，本科，主要從事保健食品功能學(xué)評價機(jī)理和方法學(xué)研究。E-mail：wenjing@ygi.edu.cn