基于麥汁培養(yǎng)基的富硒酵母培養(yǎng)條件優(yōu)化

劉 杰，陳 智，李衛(wèi)旗，徐 林，吳根福,*

(1.浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310058；2.浙江楠溪江啤酒有限公司，浙江 溫州 325100)

基于麥汁培養(yǎng)基的富硒酵母培養(yǎng)條件優(yōu)化

劉 杰1，陳 智2，李衛(wèi)旗1，徐 林2，吳根福1,*

(1.浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310058；2.浙江楠溪江啤酒有限公司，浙江 溫州 325100)

以啤酒酵母為材料，對(duì)富硒酵母的最適培養(yǎng)條件進(jìn)行研究。結(jié)果顯示：以2oBx的麥汁培養(yǎng)酵母菌，其生長(zhǎng)得率最高，過高的麥汁質(zhì)量濃度會(huì)產(chǎn)生克拉勃脫效應(yīng)而影響酵母生長(zhǎng)。在2oBx的麥汁培養(yǎng)基中適當(dāng)添加酵母提取物，可顯著提高酵母的生物量，而添加硫酸銨和磷酸二氫鉀對(duì)酵母生物量的提高不明顯；添加葡萄糖在一定程度上也能增加酵母的生物量，但這種增加會(huì)被硫酸銨抑制。培養(yǎng)基中的初始硒含量能顯著影響酵母的生物量和細(xì)胞中硒的積累，在初始質(zhì)量濃度為10mg/L(最終質(zhì)量濃度為50mg/L)的Na2SeO3初始質(zhì)量濃度下培養(yǎng)24h，酵母的生物量可達(dá)2.83g/L，細(xì)胞中積累的總硒量為266.3mg/kg。

富硒酵母；麥芽汁；克拉勃脫效應(yīng)；亞硒酸鈉

硒是一種人和動(dòng)物必需的微量元素[1]，作為谷胱甘肽過氧化物酶、硫氧還蛋白還原酶、碘化甲腺氨酸脫碘酶、硒磷酯合成酶等酶蛋白催化活性中心的組分[2]，在過氧化物的分解、自由基的清除、膜磷脂氫過氧化物的還原等生理反應(yīng)中起著十分重要的作用，具有保護(hù)細(xì)胞膜，特別是動(dòng)脈血管壁上皮細(xì)胞細(xì)胞膜，防止動(dòng)脈粥樣硬化，減少血栓和心肌梗塞發(fā)生等功能[3-4]。此外，硒還參與機(jī)體免疫力的調(diào)節(jié)[5]、有毒元素的拮抗等生理活動(dòng)[6]。硒缺乏不僅會(huì)引起克山病和大骨節(jié)病，還可導(dǎo)致白內(nèi)障、肝壞死、胰腺纖維化等疾病[7-8]。為此，世界衛(wèi)生組織于1973年將硒歸類為人和動(dòng)物必需的微量元素，并建議成人每天補(bǔ)充200μg的硒，以有效預(yù)防缺硒引起的疾病。同年，美國FDA也批準(zhǔn)亞硒酸鈉和硒酸鈉可作為飼料添加劑應(yīng)用于動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)。

自然界中的硒主要以無機(jī)硒的形式存在。雖然無機(jī)硒也能參與肝臟中谷胱甘肽過氧化物酶的合成，對(duì)缺硒引起的疾病具有預(yù)防和治療作用，但無機(jī)硒主要通過單純擴(kuò)散的方式吸收，生物利用率低；在高攝食下會(huì)促進(jìn)氧化反應(yīng)的發(fā)生，具有一定生物毒性。而有機(jī)硒主要通過甲硫氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)主動(dòng)吸收，具有食用安全性高，生物利用率強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，因而成為補(bǔ)硒添加劑的首選[9]。有報(bào)道顯示，富硒酵母對(duì)大鼠的LD50為37.3mg/kg，遠(yuǎn)高于亞硒酸鈉的5mg/kg[9]。在有機(jī)硒的開發(fā)上，國內(nèi)外已生產(chǎn)出富硒茶、富硒米、富硒豆芽等產(chǎn)品，但要實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，最好的途徑還是進(jìn)行富硒酵母的生產(chǎn)[10]。但目前有關(guān)富硒酵母發(fā)酵生產(chǎn)的報(bào)道還不多，對(duì)

其最適宜的培養(yǎng)條件還不是很清楚，沈昌等[11]曾以12oBx的糙米汁為主要原料對(duì)富硒酵母的發(fā)酵動(dòng)力學(xué)進(jìn)行過研究，確定了適宜的培養(yǎng)條件和硒添加方式。但是糙米是一種以淀粉為主要成分的基質(zhì)，所含的蛋白質(zhì)十分有限，而酵母特別是富硒酵母的生長(zhǎng)和代謝需要十分豐富的氮源。一般認(rèn)為麥芽汁是酵母生長(zhǎng)和繁殖的理想培養(yǎng)基，但有關(guān)以麥芽汁為培養(yǎng)基的富硒酵母生產(chǎn)還未見系統(tǒng)的報(bào)道。以麥芽汁為培養(yǎng)基對(duì)啤酒酵母進(jìn)行最適發(fā)酵條件和富硒條件的研究，將為富硒酵母的開發(fā)提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 菌種

啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) 浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 麥芽汁培養(yǎng)基

8kg麥芽經(jīng)粉碎后，加至有40L水的糖化鍋中，在不斷攪拌下升溫糖化(45℃浸出30min，52℃保溫30min，63℃糖化30min，70℃碘液反應(yīng)完全后，繼續(xù)維持30min), 78℃滅酶后經(jīng)麥糟層自然過濾、清液流入煮沸鍋，在煮沸過程中加入70g顆粒狀啤酒花，1kg葡萄糖并補(bǔ)水至50L，煮沸30min后泵至回旋沉淀槽，冷卻，上層清液即為制備所得麥芽汁[12]。實(shí)驗(yàn)用麥芽和啤酒花購自杭州啤酒廠。

1.2.2 YEPD培養(yǎng)基

酵母提取物5g、蛋白胨10g、葡萄糖20g、蒸餾水1000mL，pH值自然。

上述培養(yǎng)基經(jīng)0.05MPa滅菌30min，備用。

1.3 麥汁理化指標(biāo)的測(cè)定

按GB/T4928—2001《啤酒分析方法》進(jìn)行，具體方法見文獻(xiàn)[13]。

1.4 啤酒酵母的培養(yǎng)及生長(zhǎng)量的測(cè)定

250mL三角瓶中裝50mL培養(yǎng)基，滅菌后接入5mL培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期的啤酒酵母，30℃，180r/min搖瓶培養(yǎng)，每隔3h取樣測(cè)定酵母生長(zhǎng)量。酵母生長(zhǎng)量以培養(yǎng)液在波長(zhǎng)560nm處的吸光度來表示。

1.5 酵母生物量、生長(zhǎng)得率的測(cè)定

酵母生物量以每升培養(yǎng)液中酵母菌體的干質(zhì)量(g干質(zhì)量/L培養(yǎng)液)來表示；酵母生長(zhǎng)得率以每消耗1克葡萄糖所收獲的酵母菌體干質(zhì)量來表示；相對(duì)酵母生長(zhǎng)得率以各Na2SeO3濃度下的生長(zhǎng)得率與未添加Na2SeO3時(shí)的生長(zhǎng)得率的比值(百分比)來表示，以未添加Na2SeO3時(shí)的生長(zhǎng)得率作為100%。

干質(zhì)量的測(cè)定：將培養(yǎng)液在5000×g的轉(zhuǎn)速下離心20min，去上清液，沉淀用雙蒸水離心洗滌2次，60℃烘干后稱質(zhì)量。

1.6 酵母中硒含量的測(cè)定

用氫化物原子熒光光譜法，按GB/T5009.93—2003《食品中硒的測(cè)定》進(jìn)行[14]，具體參數(shù)為：負(fù)高壓340V，燈電流100mA，原子化溫度800℃，爐高8mm，載氣流速500mL/min，屏蔽氣流速1000mL/min，延遲時(shí)間1s，讀數(shù)時(shí)間15s，加液時(shí)間8s，進(jìn)樣體積2mL。結(jié)果以每千克酵母菌體(干質(zhì)量)所含總硒的毫克數(shù)來表示。

1.7 統(tǒng)計(jì)方法

正交試驗(yàn)的方差分析用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件，組間均數(shù)的兩兩比較用Student Newman Keuls Test 法[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 麥芽汁的理化性質(zhì)

對(duì)實(shí)驗(yàn)室制備的麥芽汁進(jìn)行理化性質(zhì)的測(cè)定，結(jié)果見表1。各項(xiàng)指標(biāo)基本符合優(yōu)質(zhì)麥汁的理化標(biāo)準(zhǔn)[12]，由于添加的輔助原料較少，麥汁中的氨基氮含量比較豐富，有利于酵母菌的生長(zhǎng)和繁殖。

2.2 麥芽汁培養(yǎng)基和YEPD培養(yǎng)基中酵母的生長(zhǎng)

圖 1 麥芽汁糖度對(duì)酵母生長(zhǎng)的影響Fig.1 Effect of beerwort concentration on the growth ofSaccharomyces cerevisiae

表 1 實(shí)驗(yàn)室制備麥汁的理化指標(biāo)Table 1 Physico-chemical characteristics of prepared beerwort

麥芽汁是酵母生長(zhǎng)的良好培養(yǎng)基，一般啤酒廠制備的麥芽汁糖度都在10oBx左右，可是啤酒生產(chǎn)是一種以積累代謝產(chǎn)物(主要是酒精)為主的發(fā)酵，而富硒酵母的培養(yǎng)是一種以菌體為收獲對(duì)象的發(fā)酵，因此需要較低的碳氮比。為此，進(jìn)行了富硒酵母培養(yǎng)的最適麥芽汁質(zhì)

量濃度的實(shí)驗(yàn)，并以實(shí)驗(yàn)室酵母培養(yǎng)時(shí)常用的YEPD培養(yǎng)基作為對(duì)照，根據(jù)發(fā)酵液在波長(zhǎng)560nm時(shí)的吸光度來判斷酵母的生長(zhǎng)狀況，結(jié)果見圖1(實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果相近，圖中數(shù)據(jù)為平均值)。

從圖1可以看出，隨著麥芽汁質(zhì)量濃度的增高，酵母的生長(zhǎng)量也相應(yīng)增加。4oBx和6oBx的麥芽汁，雖然營養(yǎng)物質(zhì)質(zhì)量濃度分別比2oBx麥汁增加了1倍和2倍，但其30h的生長(zhǎng)量卻只增加27%和58%，這可能與該酵母菌株在高糖質(zhì)量濃度培養(yǎng)時(shí)發(fā)生克拉勃脫效應(yīng)有關(guān)[16]。

YEPD培養(yǎng)基中雖然糖的質(zhì)量濃度也只有2%，但30h的生長(zhǎng)量與4oBx的麥汁相近，說明培養(yǎng)基中的酵母提取物和蛋白胨不僅能提供酵母生長(zhǎng)所需的微量元素和維生素，還為酵母的生長(zhǎng)提供了碳源和氮源[17]。

2.3 影響酵母生物量的主要因素

雖然用2oBx的麥芽汁進(jìn)行酵母培養(yǎng)時(shí)生長(zhǎng)得率最高，但培養(yǎng)至穩(wěn)定期時(shí)酵母懸液的光密度為5.03，只有文獻(xiàn)報(bào)道最大吸光度的一半[18]。為了確定影響酵母生物量的影響因素，以獲得單位時(shí)間內(nèi)的最大得率，提高設(shè)備利用率，以2oBx 的麥芽汁為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，進(jìn)行了添加葡萄糖、硫酸銨、磷酸二氫鉀和酵母提取物的四因素二水平正交試驗(yàn)，采用L8(27)正交表。結(jié)果見圖2及表2、3。

圖2 添加碳、氮、磷源對(duì)酵母生長(zhǎng)的影響Fig.2 Effect of carbon, nitrogen and phosphorus sources on the growth ofSaccharomyces cerevisiae

從圖2可以看出，在2oBx的麥汁中添加了0.5%酵母提取物后，酵母的生長(zhǎng)量有了顯著的提高，而添加氮、磷的試驗(yàn)組中生長(zhǎng)量提高得并不多。方差分析(表3)也表明，如果不考慮交互作用，從4個(gè)因素獨(dú)立來看，添加了0.5%酵母提取物后，30h培養(yǎng)液中酵母生物量有了極顯著的提高(P＜0.01)，說明2oBx的麥汁培養(yǎng)酵母得率不高的原因是各種營養(yǎng)物質(zhì)偏少引起的?？紤]到4oBx的麥汁或6oBx的麥汁培養(yǎng)時(shí)酵母得率提升不明顯，確定在2oBx的麥汁基礎(chǔ)上添加0.5%酵母提取物和2%葡萄糖作為酵母培養(yǎng)的最適培養(yǎng)基配方。

表 2 啤酒酵母培養(yǎng)正交試驗(yàn)及結(jié)果Table 2 Orthogonal experimental results in cultivation ofSaccharomyces cerevisiae

表 3 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析表Table 3 ANOVA analysis of orthogonal experimental design

2.4 Na2SeO3添加量對(duì)啤酒酵母生長(zhǎng)的影響

硒雖然是一種生物必需的微量元素，但質(zhì)量濃度過高會(huì)顯示出毒性，對(duì)酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)起抑制作用[19]。為了確定酵母培養(yǎng)時(shí)最適的硒添加量，在上述篩選得到的最適培養(yǎng)基配方的基礎(chǔ)上，進(jìn)行不同硒初始質(zhì)量濃度對(duì)酵母生長(zhǎng)的影響實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)24h后測(cè)定菌體生長(zhǎng)得率，發(fā)現(xiàn)硒能顯著抑制啤酒酵母菌的生長(zhǎng)，即使在10mg/L的Na2SeO3·5H2O(相當(dāng)于3mg/L的硒)質(zhì)量濃度下，抑制率也達(dá)到26.7%(圖3)。所以，為了得到較多的硒酵母，初始硒添加量不能太高。

圖3 硒添加量對(duì)酵母生長(zhǎng)得率的影響Fig.3 Effect of selenium concentration on relative yield ofSaccharomyces cerevisiae

2.5 酵母細(xì)胞中的硒含量

因?yàn)槌^30mg/L的初始Na2SeO3·5H2O(相當(dāng)于9mg/L的硒)會(huì)使酵母細(xì)胞的得率減少一半以上，在進(jìn)行富硒

酵母培養(yǎng)時(shí)，于接種前(0h)在上述最適培養(yǎng)基中分別添加5～30mg/L的Na2SeO3·5H2O，然后培養(yǎng)至12、16、19、22h后各加10mg/L的Na2SeO3·5H2O，使培養(yǎng)基中總的Na2SeO3·5H2O添加量達(dá)到45～70mg/L(相當(dāng)于13.5～21mg/L硒)。培養(yǎng)24h離心收獲菌體，烘干后測(cè)定酵母生物量及細(xì)胞所固定的硒含量，發(fā)現(xiàn)10mg/L的初始Na2SeO3·5H2O添加量既有利于獲得相對(duì)較高的酵母生物量2.83g/L，又有利于細(xì)胞中硒的富集(266.3mg/kg) (圖4)。更高的初始Na2SeO3·5H2O添加量雖然會(huì)增加酵母細(xì)胞對(duì)硒的吸收，但因酵母的生長(zhǎng)受到抑制，每升發(fā)酵液中酵母所固定的硒量反而有所減少。

圖 4 初始硒質(zhì)量濃度對(duì)酵母細(xì)胞硒積累的影響Fig.4 Effect of initial selenium concentration on selenium accumulation in yeast

3 討 論

雖然4oBx和6oBx麥芽汁的營養(yǎng)物質(zhì)質(zhì)量濃度比2oBx麥汁高1～2倍，但是酵母的生長(zhǎng)量只增加27%和58% (圖1)，這可能是因?yàn)樵诟咛菞l件下酵母的呼吸作用被抑制，經(jīng)EMP途徑產(chǎn)生的部分丙酮酸沒有進(jìn)入TCA循環(huán)，而被底物水平磷酸化，產(chǎn)生乙醇等代謝產(chǎn)物[16]。所以無論從酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)得率來看，還是從酵母培養(yǎng)后的廢液處理難度來看，用2oBx的麥汁來培養(yǎng)顯得更經(jīng)濟(jì)。

在2oBx的麥汁中添加了0.5%酵母提取物后，酵母的生長(zhǎng)量有了顯著的提高，而加氮、磷的試驗(yàn)組中酵母生長(zhǎng)量提高并不明顯(圖2)。雖然添加2%葡萄糖后，酵母生物量的增加總體上達(dá)到顯著水平(P＜0.05)，但同時(shí)添加葡萄糖和硫酸銨(組別Ⅳ)后生物量反而比對(duì)照(組別Ⅰ)低(表2、3)，說明硫酸銨與葡萄糖具有協(xié)同效應(yīng)，同時(shí)過量存在的情況下能抑制酵母菌的增殖，通過比較組別Ⅶ和組別Ⅷ的酵母生物量，可以得出同樣的結(jié)論。其機(jī)理目前還不是很清楚，可能與酵母細(xì)胞中糖原和蛋白質(zhì)的貯存有關(guān)。

Na2SeO3對(duì)酵母的抑制作用主要由培養(yǎng)基中的初始硒質(zhì)量濃度決定，因?yàn)榻湍傅慕臃N量只有5%，起始培養(yǎng)時(shí)酵母細(xì)胞數(shù)較少，且處于適應(yīng)期，對(duì)環(huán)境因子的作用比較敏感。12h后酵母的生長(zhǎng)已進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，酵母細(xì)胞以指數(shù)方式增長(zhǎng)，此時(shí)少量分批地加入Na2SeO3對(duì)酵母細(xì)胞幾乎沒有抑制作用。初始硒質(zhì)量濃度在10、20、30mg/L時(shí)培養(yǎng)所得的酵母菌體中固定的硒量相差不大，而初始硒質(zhì)量濃度在5mg/L時(shí)酵母菌體中所固定的硒量較少，說明硒是在酵母繁殖時(shí)同化至菌體細(xì)胞中的，因?yàn)榻湍冈谧畛?2h培養(yǎng)過程中積累的生物量大約占總生物量的一半(圖2)。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果還說明酵母利用無機(jī)硒的效率不高，因?yàn)榧词蛊鹗糔a2SeO3質(zhì)量濃度為10mg/L，每升發(fā)酵液中添加的總硒量達(dá)3mg；而每升發(fā)酵液培養(yǎng)24h后能得到的酵母生物量(干質(zhì)量)不足4g(表2)，按每克酵母能固定0.3mg硒(圖4)計(jì)算，所需的硒也不過是1.2mg，說明添加的硒大部分還留在培養(yǎng)基中，沒有被酵母同化。但培養(yǎng)基中硒質(zhì)量濃度低時(shí)，不易被運(yùn)送到酵母細(xì)胞內(nèi)，因?yàn)閬單徕c主要是通過單純擴(kuò)散的方式吸收的[20]。因此，為了得到具有較多生物硒的酵母菌體，以選用10mg/L的初始硒質(zhì)量濃度為好，若用5mg/L初始硒質(zhì)量濃度，應(yīng)在培養(yǎng)至6h時(shí)再加5mg/L的硒，以利于酵母的吸收同化。

一個(gè)酵母細(xì)胞理論上能夠結(jié)合的最大硒量依賴于細(xì)胞中甲硫氨酸和半胱氨酸(殘基)的含量[10]，大約為6000mg/kg。然而，硒代氨基酸完全替代甲硫氨酸和半胱氨酸是不可能的，這不僅是因?yàn)榕囵B(yǎng)環(huán)境中存在著與硒起競(jìng)爭(zhēng)作用的硫，更主要的是由于硒代半胱氨酸的摻入需要密碼子UGA(一般情況下是作為蛋白質(zhì)翻譯的終止密碼子)的介導(dǎo)[2]。如在谷胱甘肽過氧化物酶分子中，存在著2個(gè)半胱氨酸殘基，只有活性中心(第35位)的那一個(gè)可以被硒代半胱氨酸取代，另一個(gè)半胱氨酸殘基不能被取代，說明生物能特異地識(shí)別硒代半胱氨酸的密碼子，因此并非所有半胱氨酸殘基中的硫都能被硒所取代。而細(xì)胞中積累較多的硒代半胱氨酸也是不現(xiàn)實(shí)的，因?yàn)檫^多的半胱氨酸會(huì)引起Fenton反應(yīng)，產(chǎn)生大量自由基，從而影響細(xì)胞的代謝。所以，要獲得富硒酵母，有必要進(jìn)一步篩選能在細(xì)胞內(nèi)積累大量硒蛋氨酸的酵母菌種。

綜上所述，在分批培養(yǎng)過程中，高質(zhì)量濃度的培養(yǎng)基不利于生長(zhǎng)得率的提高，低質(zhì)量濃度的培養(yǎng)基又會(huì)降低設(shè)備的利用率，用補(bǔ)料分批培養(yǎng)或連續(xù)培養(yǎng)來進(jìn)行富硒酵母的發(fā)酵可能是一種比較合適的方式。

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Optimal Condition for Selenium-rich Yeast Cultivation in Beerwort Media

LIU Jie1，CHEN Zhi2，LI Wei-qi1，XU Lin2，WU Gen-fu1,*
(1. College of Life Sciences, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China；2. Zhejiang Nanxi River Brewery Company Limited, Wenzhou 325100, China)

The optimal cultivation condition for yeast growth and selenium accumulation in beerwort media was studied. Results indicated that 2oBx beerwort was a suitable medium for the growth of Saccharomyces cerevisiae and the higher concentration would reduce growth rate by Crabtree effect. The addition of yeast extract in 2oBx beerwort could significantly increase yeast biomass; while the addition of (NH4)2SO4or KH2PO4did not. In addition, although glucose addition also could improve yeast biomass, its enhancement effect could be inhibited by simultaneous addition of (NH4)2SO4. Initial selenium concentration in media could remarkably improve yeast biomass and enhance selenium accumulation. At the initial concentration of 10 mg/L Na2SeO3, yeast biomass and accumulated selenium reached up to 2.83 g/L and 266.3 mg/kg, respectively.

selenium-rich yeast；beerwort；Crabtree effect；Na2SeO3

TS201.3

A

1002-6630(2010)09-0206-05

2009-10-11

劉杰(1985—)，男，碩士研究生，主要從事微生物方面的研究。E-mail：liujie1505@163.com

*通信作者：吳根福(1965—)，男，副教授，博士，主要從事微生物方面的研究。E-mail：wugenfu@zju.edu.cn