芹菜葉提取物抗氧化作用研究

吳韶梅，哈 婧，劉小爭，沈 芳，郝 葉

(河北科技大學(xué)化學(xué)與制藥工程學(xué)院，河北 石家莊 050018)

芹菜葉提取物抗氧化作用研究

吳韶梅，哈 婧，劉小爭，沈 芳，郝 葉

(河北科技大學(xué)化學(xué)與制藥工程學(xué)院，河北 石家莊 050018)

以索氏提取法用60%乙醇提取芹菜葉中的黃酮類物質(zhì)，分別采用生化試劑盒法測定其總抗氧化能力及對羥自由基(·OH)、超氧陰離子自由基(O2·)的清除能力，另對不同油脂的抗氧化性能進(jìn)行檢測，評價芹菜葉提取物的體外抗氧化作用。結(jié)果表明：芹菜葉乙醇提取物具有較強(qiáng)的抗氧化作用和清除·OH、O2·的能力，并且隨提取物質(zhì)量濃度增大，其總抗氧化能力及清除自由基能力增強(qiáng)，表現(xiàn)出明顯的量效關(guān)系；芹菜葉乙醇提取物有顯著的防止油脂氧化的作用，其效果優(yōu)于VC。

芹菜；黃酮；索氏提取法；自由基；抗氧化作用

自由基具有高度的氧化活性，攻擊破壞細(xì)胞，疾病與衰老過程都與體內(nèi)自由基過量有關(guān)[1-2]。對抗氧化藥物的研究是自由基醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域中的重點和熱點問題[3]。在食品中廣泛應(yīng)用的合成抗氧化劑如丁基羥基茴香醚(BHA)、二丁基羥基甲苯(BHT)等由于具有潛在毒性和致癌作用而受到人們的排斥，天然產(chǎn)物中含有的抗氧化活性成分由于其安全性高因而受到了更廣泛的關(guān)注[4-6]。

黃酮類化合物在油脂中的抗氧化活性的研究已有不少報道[7]。芹菜(Opium graveolens L．)屬傘形花科一年生或二年生草本植物，異名藥芹、旱芹[8]，資源豐富，含有芹菜甲素、芹菜乙素、水蓼素、7-甲基水蓼素等黃酮類化合物[9]?；谇鄄酥悬S酮類物質(zhì)含量豐富，以適宜的方法對其進(jìn)行提取并對其抗氧化性能進(jìn)行科學(xué)的評價，對芹菜的充分利用和深加工具有重要意義。嚴(yán)建剛等[10]以化學(xué)發(fā)光法測定了芹菜不同提取物清除自由基的能力，本實驗以生化試劑盒法對芹菜提取物清除自由基的能力進(jìn)行檢測，并考察其對油脂的抗氧化作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

芹菜、食用花生油、調(diào)和油 市購；芹菜洗凈取葉片備用。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(純度92%) 中國藥品生物制品檢定所；總抗氧化能力測定試劑盒、清除羥自由基試劑盒、抗超氧陰離子自由基試劑盒 南京建成生物工程研究所；無水乙醇(分析純) 天津市永大化學(xué)試劑開發(fā)中心；石油醚、氫氧化鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉、冰乙酸、氯仿均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

752型紫外-可見分光光度計 上海洪欣儀器有限公司；150mL索式提取器；DF-Ⅱ型集熱式磁力加熱攪拌器 江蘇省金壇市宏華儀器廠；YKH-型液體快速混合

器 江西醫(yī)療器械廠。

1.3 方法

1.3.1 芹菜葉中黃酮類物質(zhì)的提取

將新鮮的芹菜葉粉碎，低溫烘干至恒質(zhì)量后過60目篩，精密稱量5.0911g芹菜葉干粉于索氏提取器中用石油醚萃取至回流液無色，以150mL 60%的乙醇80℃提取3h。提取液趁熱抽濾，濾液靜置過夜，過濾去除不溶物，定容至100mL，備用。

1.3.2 芹菜葉中總黃酮含量的測定

以蘆丁作為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到的吸光度A與蘆丁質(zhì)量濃度(C)關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：A＝0.0125C－0.0118，r＝0.9996，蘆丁質(zhì)量濃度在0.01～0.05mg/mL范圍內(nèi)呈良好線性相關(guān)。精密吸取2mL樣液，加入10mL具塞刻度試管中，依Al(NO3)3-NaNO2-NaOH顯色法[11-12]測得吸光度A=0.534，得出C=43.624mg/L，據(jù)此計算得出上述芹菜葉提取液的總黃酮質(zhì)量濃度為218.12mg/L。

1.3.3 芹菜葉提取物總抗氧化能力的測定

將1.3.1節(jié)提取物溶液用60%乙醇稀釋成6.2、7.3、8.7、10.9、13.6、21.8mg/L測定液備用。測定原理：抗氧化物質(zhì)能使Fe3+還原成Fe2+，F(xiàn)e2+可與鄰二氮菲結(jié)合形成穩(wěn)定的Fe2+-鄰二氮菲絡(luò)合物，可通過比色法測定，從而推知體系的總抗氧化能力。測定方法：參考總抗氧化能力測定試劑盒說明書操作，于520nm波長處測各管吸光度。37℃條件下，每分鐘每毫升測定液使反應(yīng)體系吸光度增加0.01為一個抗氧化能力單位(U/mL)。經(jīng)實驗確定加入測定液體積為0.2mL。每個質(zhì)量濃度測定重復(fù)3次。

1.3.4 芹菜葉提取物清除羥自由基能力的測定

將1.3.1節(jié)提取物溶液用60%乙醇稀釋成3.4、6.8、13.6、27.3、54.5、109.1、163.6、218.1mg/L測定液。反應(yīng)原理：Fe3+與H2O2反應(yīng)，H2O2被分解成·OH和OH－，gress試劑使之顯紅色，其呈色與·OH的量成正比。測定方法：參考Fenton測定試劑盒說明書操作，于550nm波長處測定各管吸光度。以近似質(zhì)量濃度VC作為對照，比較二者清除羥自由基能力的強(qiáng)弱。經(jīng)實驗確定加入測定液體積為0.2mL。每個質(zhì)量濃度測定重復(fù)3次。

1.3.5 芹菜葉提取物清除超氧陰離子自由基能力的測定

將1.3.1節(jié)提取物溶液用60%乙醇將該溶液稀釋成27.3、43.6、72.7、109.1、160、218.1mg/L測定液備用。測定原理：模擬機(jī)體中黃嘌呤與黃嘌呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)，產(chǎn)生超氧陰離子自由基O2·，加入電子傳遞物質(zhì)及gress氏顯色劑，使反應(yīng)體系呈現(xiàn)紫紅色，可用分光光度計測其吸光度，當(dāng)被測樣本中含有O2·抑制劑時，則比色時測定管的吸光度低于對照管的吸光度，以VC做為標(biāo)準(zhǔn)，可計算出被測物品對O2·的清楚能力。測定方法：采用生化試劑盒法，參考抗超氧陰離子自由基測定試劑盒說明書操作，于550nm波長處測定各管吸光度。經(jīng)實驗確定加入測定液體積為0.05mL。每個質(zhì)量濃度測定重復(fù)3次。

1.3.6 芹菜葉提取物對不同油脂抗氧化性的測定

測定方法：采用碘量法[13-14]，分別取20g新鮮調(diào)和油和花生油各3份，移入250mL燒杯，取1份調(diào)和油加入1.3.1節(jié)提取液5mL，第2份調(diào)和油加入0.5% VC 5mL作為對照，另1份作為空白。對花生油的操作同調(diào)和油。將所有已加入抗氧化物質(zhì)的樣品于70℃條件下在磁力攪拌器上加熱攪拌30min，使充分溶解，隨后移入碘量瓶中，密封置 65℃恒溫箱內(nèi)避光保存，僅當(dāng)取樣測定時才打開瓶塞。每隔24h 分別搖勻攪拌2min，并交換它們在恒溫箱中的位置，定期取樣測定。

在 24、48、72、120、168h精密稱取2g混勻的油樣，置于250mL碘量瓶中，加入30mL氯仿-冰醋酸溶液(氯仿與冰醋酸體積比2∶3)，使樣品完全溶解。加入飽和碘化鉀溶液，塞緊瓶塞，并置于快速混勻器上振搖30s，暗處放置3min，取出加100mL水搖勻，立即用經(jīng)標(biāo)定過的0.002mol/L Na2S2O3標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至淡黃色，加淀粉指示液1mL，繼續(xù)滴定至藍(lán)色消失為終點。同時做空白。

式中：POV為油脂過氧化值；V為消耗Na2S2O3的體積/mL；c為Na2S2O3的濃度/(mol/L)；m為樣品的質(zhì)量/g。

2 結(jié)果與分析

2.1 芹菜葉乙醇提取物的總抗氧化能力

圖 1 芹菜葉乙醇提取物總抗氧化能力測定結(jié)果Fig.1 Total antioxidant capacity of celery extract

從圖1可以看出，芹菜葉乙醇提取物具有較強(qiáng)的抗氧化能力，并且隨提取物中黃酮質(zhì)量濃度增大，總抗氧化能力增強(qiáng)，表現(xiàn)出明顯的量效依賴關(guān)系。

2.2 芹菜葉乙醇提取物清除羥自由基的能力

圖 2 芹菜葉乙醇提取物及VC清除羥自由基能力的比較Fig.2 Comparison of scavenging capabilities between celery extract and vitamin C to hydroxyl free radical

從圖2可知，F(xiàn)eSO4-H2O2體系中，VC和芹菜葉乙醇提取物都具有明顯的清除·OH的能力，在3.4～163.6mg/L之間時黃酮質(zhì)量濃度與清除·OH的能力具有良好的量效關(guān)系，其IC50值為31.3mg/L。當(dāng)質(zhì)量濃度超過163.6mg/L時，黃酮對·OH的清除能力會略有下降。這可能與在鐵離子及氧存在時黃酮類化合物會自動氧化生成超氧化物或過氧化氫，表現(xiàn)出一定的促氧化作用有關(guān)[15]。在較低質(zhì)量濃度范圍內(nèi)VC清除·OH能力強(qiáng)于芹菜葉乙醇提取物，在100mg/L時芹菜葉乙醇提取物清除·OH能力與等質(zhì)量濃度VC相當(dāng)。

2.3 芹菜葉乙醇提取物清除超氧陰離子自由基的能力

圖 3 芹菜葉乙醇提取物清除超氧陰離子自由基測定結(jié)果Fig.3 Scavenging capability of celery extract to superoxide anion free radical

從圖3可以看出，隨著芹菜葉乙醇提取物質(zhì)量濃度的升高，抑制率呈上升趨勢。提取物質(zhì)量濃度與清除O2·的能力具有良好的量效關(guān)系。隨著提取物質(zhì)量濃度的增大，抑制能力逐漸增強(qiáng)。芹菜葉乙醇提取物對黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶體系產(chǎn)生的O2·有較強(qiáng)的清除作用，提取物清除O2·的IC50值為148.8mg/L。

2.4 芹菜葉乙醇提取物對不同油脂抗氧化性的測定結(jié)果

POV值越高，說明樣品越易被氧化。從圖4可知，在相同條件下調(diào)和油更容易被氧化，其過氧化值較高。加入抗氧化劑對于油脂的抗氧化有明顯的保護(hù)作用。芹菜葉乙醇提取物有較強(qiáng)的抗油脂氧化的作用，在質(zhì)量濃度相當(dāng)?shù)那闆r下，加入芹菜葉乙醇提取物比加入VC的抗氧化作用更顯著。

圖 4 不同油脂POV值測定結(jié)果Fig.4 POV of different oils and fats

3 結(jié) 論

用索氏提取法以乙醇為溶劑對芹菜葉中總黃酮進(jìn)行了提取，以生化試劑盒法測得提取物對·OH和O2·都有顯著的清除作用，該方法操作簡便，靈敏快速。由于試劑盒的制備使用都非常嚴(yán)格，與常規(guī)操作方法相比，其測定結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。因此試劑盒法可應(yīng)用于天然產(chǎn)物抗氧化作用的檢測。同時，該提取物有顯著的防止油脂氧化的作用，其抗氧化能力優(yōu)于近似質(zhì)量濃度VC。因此，芹菜葉乙醇提取物可以作為天然抗氧化劑使用，并且可以添加到食品保健品中。作者的前期實驗數(shù)據(jù)表明，芹菜葉中的黃酮含量高于莖中2～3倍。芹菜葉乙醇提取物分離純化及其抗氧化作用機(jī)理有待深入研究。

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Antioxidant Effect of Celery Extract

WU Shao-mei，HA Jing，LIU Xiao-zheng，SHEN Fang，HAO Ye
(College of Chemistry and Pharmaceutical Engineering, Hebei University of Science and Technology, Shijiazhuang 050018, China)

Soxhlet extraction was used to extract flavonoids from celery. The antioxidant effect of celery extract was also investigated. The total antioxidant capacity and scavenging capability to free radicals were determined. Results showed that celery extract had strong anti-oxidation effect and scavenging capability to ·OH and O2·. The increasing concentration of celery extract resulted in an enhanced anti-oxidation effect and scavenging capability to free radicals. Ethanol extract from celery also exhibited an obvious effect on the prevention of oil oxidation, which was stronger than that of vitamin C.

celery；flavonoid；Soxhlet extraction；free radical；antioxidant effect

TS255.1

A

1002-6630(2010)09-0103-03

2009-09-07

河北科技大學(xué)大學(xué)生科技創(chuàng)新基金項目

吳韶梅(1978—)，女，講師，碩士，研究方向為天然產(chǎn)物開發(fā)。E-mail：wushaomei126@126.com