乳酸菌發(fā)酵酸豆乳香氣成分分析及評(píng)價(jià)

張 佳，馬永昆,,*，崔鳳杰，陳 凡，孫樂(lè)六，夏 蓉

(1.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；2.江蘇省農(nóng)產(chǎn)品生物加工與分離工程技術(shù)研究中心，江蘇 鎮(zhèn)江 212004)

乳酸菌發(fā)酵酸豆乳香氣成分分析及評(píng)價(jià)

張 佳1，馬永昆1,2,*，崔鳳杰1，陳 凡1，孫樂(lè)六2，夏 蓉2

(1.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；2.江蘇省農(nóng)產(chǎn)品生物加工與分離工程技術(shù)研究中心，江蘇 鎮(zhèn)江 212004)

采用頂空固相微萃取(SPME)與氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)聯(lián)用檢測(cè)分析技術(shù)，并結(jié)合感官評(píng)分法對(duì)保加利亞乳桿菌、瑞士乳桿菌和嗜熱鏈球菌3種乳酸菌混合發(fā)酵的豆乳進(jìn)行香氣分析和評(píng)價(jià)，探討不同乳酸桿菌及其與嗜熱鏈球菌按比例混合發(fā)酵對(duì)酸豆乳香氣的影響。感官評(píng)定結(jié)果表明，乳酸菌種及其混合比例對(duì)發(fā)酵酸豆乳的香氣有明顯影響。香氣檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，對(duì)比發(fā)酵前樣品，發(fā)酵后酸豆乳中酮類(lèi)、酸類(lèi)含量顯著增加，而醛類(lèi)和醇類(lèi)含量明顯減少，3種酸豆乳中相同關(guān)鍵香氣成分含量有差異。感官評(píng)定與香氣檢測(cè)分析結(jié)果一致，1:1的保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌組成的菌種產(chǎn)香濃郁，產(chǎn)酸力高，是豆乳發(fā)酵的優(yōu)選菌種。

乳酸菌；酸豆乳；固相微萃取(SPME)；氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)；香氣

大豆(Glycine max(L.) Merr.)為蝶形花科大豆屬一年生草本植物種子，富含蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸、維生素、黃酮等成分，具有輔助降血脂、抑制腫瘤和阻止動(dòng)脈硬化等作用[1]。乳酸菌發(fā)酵的酸豆乳可保留大豆的營(yíng)養(yǎng)功能成分，賦予豆乳特有的乳酸發(fā)酵清香、醇香和酯香等，乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的多種蛋白水解酶可使大豆蛋白水解為小分子肽和氨基酸，有利于人體的消化吸收[2]。國(guó)內(nèi)酸豆乳的研究已有十余年時(shí)間，但還沒(méi)有投入工業(yè)化生產(chǎn)，主要原因是缺少適合酸豆乳生產(chǎn)的專用菌種，導(dǎo)致其風(fēng)味存在明顯的缺陷[3]。

豆乳乳酸菌發(fā)酵可產(chǎn)生乳酸、檸檬酸和乙酸等有機(jī)酸，并將檸檬酸代謝過(guò)程中產(chǎn)生的α-乙酰乳酸轉(zhuǎn)變成具有發(fā)酵豆乳制品特征香氣的丁二酮。同時(shí)乳酸菌發(fā)酵過(guò)程中生成的小分子肽和氨基酸，不僅具有一定的生物活性，還會(huì)發(fā)生進(jìn)一步脫氨反應(yīng)，生成酮、醛、醇和酸等成分，形成特有的酸豆乳發(fā)酵香[4-5]。本研究從已收集的乳酸菌中篩選出適合豆乳發(fā)酵的菌種，利用頂空固相微萃取(SPME)富集、氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)聯(lián)用分析檢測(cè)發(fā)酵豆乳的主要香氣成分，并結(jié)合感官評(píng)定，較全面地分析評(píng)價(jià)了酸豆乳發(fā)酵香氣成分，為篩選確定適合高質(zhì)量豆乳發(fā)酵的乳酸菌提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆 產(chǎn)地山東；純牛奶 蒙牛乳業(yè)股份有限公司。保加利亞乳桿菌(Lactobacillus bulgaricus)、嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus) 江蘇大學(xué)超高壓食品技術(shù)研究所保藏；瑞士乳桿菌(L a c t o b a c i l l u s helveticus) 丹尼斯克(中國(guó))有限公司；氫氧化鈉(分析純) 上?；瘜W(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

雙極性50μm聚二甲基硅氧烷PDMS萃取纖維頭 美國(guó)Supelco公司；HP6890/5973氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國(guó)Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 酸豆乳制作工藝流程

大豆→去雜→浸泡→熱燙→磨漿→膠磨→過(guò)濾→加入牛奶得豆乳(豆?jié){:牛奶體積比為8:2)，然后加入糖(4g/ 100mL 豆乳)→均質(zhì)→灌裝→殺菌→冷卻→接種(體積分?jǐn)?shù)4%接種量)→發(fā)酵→冷藏后熟→檢測(cè)

在前期工作的基礎(chǔ)上，將篩選的單菌種進(jìn)行不同方式的組合，并接種發(fā)酵。LBS1代表由L.bulgaricus和S.thermophilus按照體積比1:1混合發(fā)酵所得的酸豆乳，LHS代表由L. helveticus和S.thermophilus按照1:1混合發(fā)酵所得的酸豆乳，LBS2代表由L.bulgaricus和S.thermophilus按照2:1混合發(fā)酵所得的酸豆乳。

1.3.2 酸度測(cè)定方法

依照GB/T 5409—85《牛乳檢測(cè)方法》進(jìn)行。

1.3.3 感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)

選20名經(jīng)培訓(xùn)合格的食品專業(yè)人員作為品評(píng)員，評(píng)定方法如下：以豆乳(豆?jié){:牛奶體積比為8:2)為對(duì)照，采用嗅聞法對(duì)不同的酸豆乳打分，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行方差分析。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：1) 0～2分：無(wú)明顯發(fā)酵香氣；2) 3～5分：有輕微發(fā)酵香氣；3) 6～8分：有正常發(fā)酵香氣；4) 9～11分：有濃郁發(fā)酵香氣(每個(gè)樣品評(píng)3次)。LBS1、LHS和LBS2的發(fā)酵酸度分別為73、86.6、64.2°T。

1.3.4 樣品處理方法

將首次使用的PDMS固相微萃取頭在氣相色譜進(jìn)樣口老化至無(wú)雜峰，在250℃下老化30min。吸取10mL樣品放入15mL樣品瓶中，在40℃加熱平臺(tái)上保持10min，將SPME萃取頭插入瓶中，磁力攪拌速度100r/min，40℃條件下萃取30min。

1.3.5 GC-MS參數(shù)條件

色譜條件：色譜柱：毛細(xì)管色譜柱DB-WAX(60m ×0.25mm，0.25μm)；進(jìn)樣口溫度250℃，SPME插入進(jìn)樣孔解吸3min；程序升溫：始溫35℃，保持3min，以3℃/min升至80℃，再以4℃/min升至120℃，再以10℃/min升至230℃，保持8min；載氣(He)流速1.0mL/ m i n，不分流。

質(zhì)譜條件：接口溫度280℃，離子源溫度230℃，電子能量70eV，質(zhì)量掃描范圍33～450u。

1.3.6 定性定量方法

用HP化學(xué)工作站軟件對(duì)照NIST庫(kù)進(jìn)行數(shù)據(jù)收集，成分先由譜庫(kù)初步鑒定，再結(jié)合化學(xué)成分的保留時(shí)間、質(zhì)譜、實(shí)際成分和保留指數(shù)等進(jìn)行定性；采用面積歸一化法進(jìn)行相對(duì)定量。

2 結(jié)果與分析

圖1 豆乳香氣的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of aroma components of soymilk

圖2 酸豆乳L(zhǎng)BS1香氣的總離子流圖Fig.2 Total ion chromatogram of aroma components of soymilk yogurt LBS1

圖3 酸豆乳L(zhǎng)HS香氣的總離子流圖Fig.3 Total ion chromatogram of aroma components of soymilk yogurt LHS

圖4 酸豆乳L(zhǎng)BS2香氣的總離子流圖Fig.4 Total ion chromatogram of aroma components of soymilk yogurt LBS2

豆乳和不同乳酸菌發(fā)酵酸豆乳總離子圖見(jiàn)圖1～4。豆乳和不同酸豆乳香氣成分，見(jiàn)表1。

表1 豆乳和酸豆乳香氣成分的分析結(jié)果Table1 Analytical results of volatile components in soymilk and different soymilk yogurts

2.1 酸菌發(fā)酵對(duì)酸豆乳香氣成分的影響

豆乳中共檢測(cè)出31種，其中主要香氣成分是醇、醛類(lèi)，相對(duì)含量分別為45.34%和24.12%。含量相對(duì)較高的成分有正己醛(22.63%)、正己醇(18.87%)、1-辛烯-3醇(20.26%)和2-戊基呋喃(2.35%)。這與Wang等[6]、Alaoua等[7-8]檢測(cè)確定的豆乳主要香氣成分基本相同，通常呈現(xiàn)大豆的青腥氣，這些異味成分是大豆破碎打漿過(guò)程中大豆中的亞麻酸、亞油酸等在脂氧合酶及氧氣的共同作用下催化生成的，主要是C6～C9的醛、醇類(lèi)物質(zhì)[9-10]。酸豆乳L(zhǎng)BS1、LHS和LBS2中分別測(cè)出36、3 7和3 4種香氣成分，由酮、酸、醇、醛、酯類(lèi)和呋喃構(gòu)成，主要香氣成分是酮、酸、醇和醛類(lèi)。其中，酮類(lèi)相對(duì)含量為16.35%～23.28%，酸類(lèi)為13.76%～22.38%，醇類(lèi)為18.48%～22.70%，醛類(lèi)為4.34%～5.56%。

分析結(jié)果表明，豆乳發(fā)酵前后的香氣種類(lèi)和含量存在明顯差異。發(fā)酵后的酸豆乳中酮、酸物質(zhì)的種類(lèi)和相對(duì)含量明顯增多，而醇、醛物質(zhì)含量明顯減少，如2,3-丁二酮在豆乳中未檢出，而在LBS1、LHS和LBS2中其相對(duì)含量分別達(dá)到了5.98%、5.04%和4.42%。這是因?yàn)棣?乙酰乳酸在微生物作用下被分解成3-羥基丁酮后，進(jìn)一步氧化生成丁二酮[11]；乙酸由發(fā)酵前的0.28%分別增加到6.93%、14.98%和8.22%，主要是因?yàn)槿樗峋l(fā)酵糖產(chǎn)生了乳酸、乙酸和丙酸等，也可能通過(guò)氨基酸代謝生成乙酸、丁酸和戊酸等[12]；但正己醛則由發(fā)酵前的22.63%分別降低到發(fā)酵后的0.25%、0.15%和0.50%，正己醇從18.87%降低到8.82%、9.81%和10.57%。這是由于豆乳經(jīng)乳酸菌發(fā)酵可將羰基化合物轉(zhuǎn)化為酮、醇類(lèi)和有機(jī)酸[13]，表明乳酸菌發(fā)酵可明顯減輕豆乳的豆腥味，并改善其香氣質(zhì)量。

2.2 不同菌種發(fā)酵對(duì)酸豆乳香氣的影響

表2 酸豆乳中主要揮發(fā)性香氣的描述及其閾值Table2 Description and odor threshold of volatile compounds in soymilk yogurt LBS1

LBS1共檢測(cè)到36種香氣成分，主要由酮、酸、醛、醇和酯類(lèi)構(gòu)成。其中酮類(lèi)10種，相對(duì)含量為23.28%，其次是醇類(lèi)18.48%、酸類(lèi)14.38%、醛類(lèi)5.56%和酯類(lèi)1.03%，它們呈現(xiàn)清香、甜香、醇香、微弱的酸氣和特有的乳酸發(fā)酵香。其中占酮類(lèi)含量18.73%的丁酮類(lèi)、2-庚酮和3-己酮對(duì)LBS1的香氣有較大的影響，它們的閾值較低，主要表現(xiàn)出清香、脂香和甜香(表2)，很可能是其發(fā)酵產(chǎn)生的特征香氣成分[14,16,20]。同時(shí)，LBS1中重要香氣物質(zhì)乙醛和丁二酮的含量分別為5.98%和2.06%，均高于LHS和LBS2兩種酸豆乳，且乙醛與丁二酮的含量比值為0.345，與Marilley等[21]、王琴等[22]和Wang等[23]報(bào)道的乳酸菌種產(chǎn)香質(zhì)量的評(píng)價(jià)指標(biāo)相近。因此，LBS1呈現(xiàn)的清香、甜香、脂香和乳酸發(fā)酵香較LHS、LBS2協(xié)調(diào)和濃郁。

LHS共檢測(cè)到37種香氣成分，主要由酸、酮、醇、醛和酯類(lèi)構(gòu)成。其中酸類(lèi)有5種，相對(duì)含量為22.38%，其次是酮類(lèi)21.42%、醇類(lèi)19.25%和醛類(lèi)4.34%。和LBS1相比，LHS中丁酮類(lèi)和醛類(lèi)的含量略低。但因LHS中乙酸、己酸和辛酸等酸類(lèi)所占的相對(duì)含量最大，它們的沸點(diǎn)低，揮發(fā)濃度高，對(duì)LHS香氣影響較大，而揮發(fā)濃度低的酮類(lèi)和醛類(lèi)對(duì)LHS的影響則相對(duì)較小，酸類(lèi)所呈現(xiàn)的尖酸和酪香強(qiáng)于醛酮類(lèi)[16]。在LHS中，乙醛與丁二酮的含量比為0.286，低于文獻(xiàn)[22]所確定的量比范圍。LHS主要呈現(xiàn)豆乳的發(fā)酵清甜香、脂香，但帶有較刺激的酸味。

LBS2共檢測(cè)到34種香氣成分，主要由醇、酮、酸和醛類(lèi)構(gòu)成，其中醇類(lèi)相對(duì)含量為22.70%、酮類(lèi)16.35%、酸類(lèi)13.76%和醛類(lèi)5.20%。在LBS2的香氣成分中也含有呈甜香的丁酮類(lèi)以及具有刺激味的乙酸等，但與LBS1、LHS相比，它們的含量相對(duì)最低，而閾值較低的正己醇、1-辛烯-3-醇和2-戊基呋喃的相對(duì)含量最高，它們占總香氣成分的41.48%，這些醇和呋喃物質(zhì)呈濃郁的大豆青腥氣[6]。說(shuō)明此混合菌種還不能很好適應(yīng)豆乳的發(fā)酵，可能沒(méi)有將豆乳中的豆腥味化合物轉(zhuǎn)化為酮酸類(lèi)，結(jié)果只呈現(xiàn)微弱的發(fā)酵香。

上述分析表明，3種酸豆乳的香氣主要由清甜香、果香和脂香構(gòu)成，它們的香氣構(gòu)成成分、數(shù)量和相互比例不同，其呈現(xiàn)的發(fā)酵香氣強(qiáng)度不同。LBS1中酮類(lèi)的相對(duì)含量較大，且主要香氣種類(lèi)量比協(xié)調(diào)，其具有濃郁的清甜香和奶油香；其次是LHS，其醛酮類(lèi)含量居中，具有正常的發(fā)酵清甜香氣，但因酸類(lèi)含量過(guò)高而帶有刺激、尖酸氣息；LBS2中酮和酸類(lèi)的相對(duì)含量最低，而醇類(lèi)和呋喃含量最高，其清甜香淡薄，青香突出，發(fā)酵香氣最弱。

2.3 發(fā)酵菌種對(duì)酸豆乳香氣強(qiáng)度的影響

表3 不同酸豆乳的感官評(píng)分結(jié)果Table3 Results of sensory evaluation results of different soymilk yogurts

方差分析結(jié)果：

結(jié)果表明，在α＝0.05水平上，酸豆乳之間的差異顯著，品評(píng)員之間的差異也顯著。

進(jìn)一步采用LSD(least significant difference)檢驗(yàn)不同酸豆乳分?jǐn)?shù)平均值之間的差異。而LBS1、LHS和LBS2的分?jǐn)?shù)平均值分別為9.38、7.15和3.92，任意兩種酸豆乳之間分?jǐn)?shù)平均值的差值均大于0.454，表明任意兩者之間差異顯著，且按照香氣由強(qiáng)到弱排序?yàn)長(zhǎng)BS1＞LHS＞LBS2。結(jié)果說(shuō)明豆乳經(jīng)過(guò)發(fā)酵后其產(chǎn)生的一些香氣物質(zhì)的種類(lèi)、含量及其相互比例對(duì)酸豆乳的香氣有顯著影響，且不同菌種組合發(fā)酵所得酸豆乳的香氣強(qiáng)度存在顯著差異。這與發(fā)酵酸豆乳的香氣分析結(jié)果及Buono等[24]、Pinthong等[25]和馬永昆[26]的研究結(jié)果相吻合，即豆乳發(fā)酵時(shí)，采用1:1的L.bulgaricus和S.thermophilus發(fā)酵得到的酸豆乳的風(fēng)味最佳。

3 結(jié) 論

3.1 經(jīng)SPME-GC-MS檢測(cè)分析，豆乳有31種香氣成分，它們由醇、醛、酮、酸、酯類(lèi)和呋喃構(gòu)成，其中以醇、醛類(lèi)為主，含量分別占45.34%和24.12%。酸豆乳L(zhǎng)BS1、LHS和LBS2分別測(cè)出36、37、34種香氣成分，它們由酮、酸、醇、醛和酯類(lèi)構(gòu)成，以酮、酸、醇和醛類(lèi)為主，其中酮類(lèi)占16.35%～23.28%，酸類(lèi)占13.76%～22.38%，醇類(lèi)占18.48%～22.70%，醛類(lèi)僅占4.34%～5.56%。豆乳與發(fā)酵酸豆乳的香氣在種類(lèi)和含量上有明顯差異。

3.23 種發(fā)酵酸豆乳的香氣主要由清甜香、脂香和特有的乳酸發(fā)酵香構(gòu)成，它們香氣的構(gòu)成成分、含量和相互比例不同導(dǎo)致其呈現(xiàn)不同的發(fā)酵香氣。進(jìn)行發(fā)酵酸豆乳感官評(píng)價(jià)，并按照發(fā)酵香氣由強(qiáng)到弱的排序?yàn)長(zhǎng)BS1＞LHS＞LBS2， 即由1:1的L.bulgaricus和S.thermophilus組成的菌種產(chǎn)香濃郁，產(chǎn)酸力高，是豆乳發(fā)酵的優(yōu)選菌種。

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Determination and Evaluation of Volatile Components of Soymilk Yoghurts Fermented by Lactic Acid Bacteria

ZHANG Jia1，MA Yong-kun1,2,*，CUI Feng-jie1，CHEN Fan1，SUN Le-liu2，XIA Rong2
(1. School of Food and Biological Engineering, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China；2. Biological Processing and Separation Engineering Technology Research Center of Jiangsu Province, Zhenjiang 212004, China)

The volatile components of the soymilk yoghurts fermented by Streptococcus thermophilus plus Lactobacillus bulgaricus (1:1 or 1:2 mixing ratio) or Lactobacillus helveticus (1:1 mixing ratio) were analyzed using headspace solid phase microextraction (SPME) combined with gas chromatograph/mass spectrometer (GC-MS) and sensory evaluation was conducted for these yoghurt samples. The effects of different species of Lactobacillu and mixing ratio for Lactobacillu and Streptococcus thermophilus on the volatile components of soymilk yoghurts were explored. In comparison with pre-fermented soymilk, all the three soymilk yoghurts showed significantly higher contents of ketones and acids but significantly lower contents of aldehydes and alcohols. The contents of the key flavor compounds found in all of them were different. The results of evaluation were consistent with those of aroma composition analysis. The soymilk yoghurt produced with Streptococcus thermophilus plus Lactobacillus bulgaricus at 1:1 mixing ratio had strong aroma and high acidity. Therefore, an excellent fermentation starter has been found for the production of soymilk yoghurt through this study.

lactic acid bacteria；soymilk yoghurt；SPME；GC-MS；aroma

TS214.2

A

1002-6630(2010)20-0298-05

2009-12-29

江蘇大學(xué)高級(jí)人才專項(xiàng)(1283000126)

張佳(1982—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称钒l(fā)酵與風(fēng)味。E-mail：zhang99jia@163.com

*通信作者：馬永昆(1963—)，男，教授，博士后，研究方向?yàn)槭称贩菬峒庸?、食品風(fēng)味化學(xué)與食品發(fā)酵工程。E-mail：mayongkun@ujs.edu.cn