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    螺旋藻蛋白酶解肽對腹腔黏膜系統(tǒng)的作用

    2010-03-21 07:24:44劉小娟龐廣昌王連芬
    食品科學 2010年21期
    關鍵詞:螺旋藻家兔細胞因子

    劉小娟,龐廣昌,*,王連芬,2

    螺旋藻蛋白酶解肽對腹腔黏膜系統(tǒng)的作用

    劉小娟1,龐廣昌1,*,王連芬1,2

    (1.天津市食品生物技術重點實驗室,天津商業(yè)大學生物技術與食品科學學院,天津 300134;2.中國食品雜志社,北京 100050)

    目的:探索螺旋藻(Spirulina)堿性蛋白酶酶解肽對家兔腹腔黏膜系統(tǒng)的作用。方法:采用鹽析法從螺旋藻中提取可溶性螺旋藻蛋白,以堿性蛋白酶水解得到螺旋藻蛋白水解物溶液。將所得水解物以3種方式(口服、腹腔注射、耳靜脈注射)對家兔給藥,分別在給藥3、2、2h后,用ELISA試劑盒測定血清中IL-1β、IL-6、IL-12、IFN-γ、TNF-α、IL-1Ra、IL-4、IL-10、TGF-β細胞因子的質量濃度。結果:3個實驗組與正常生理鹽水組相比,IL-12質量濃度均下降,IFN-γ、IL-10質量濃度均升高;在3種給藥方式中,腹腔注射效果最顯著,其他兩組細胞因子水平均沒有顯著性變化。腹腔注射組中炎癥細胞因子IL-1β、IL-6、IL-12、TNF-α的質量濃度均顯著性降低,抗炎細胞因子IL-1Ra和IL-4顯著性升高,說明該螺旋藻堿性蛋白酶酶解肽對降低免疫活性起到了一定作用。結論:腸黏膜系統(tǒng)對螺旋藻蛋白酶解肽信號傳遞主要是通過腸道上皮細胞、內(nèi)皮細胞及單核/巨噬細胞、淋巴細胞之間的信號網(wǎng)絡抑制NF-κB和PKC/p38/MAPK途徑來降低免疫的。這與植物非營養(yǎng)物質能夠通過抑制轉錄因子NF-κB活性抑制炎癥信號級聯(lián)的作用機制相一致,說明短肽類成分也可以進入體內(nèi)對機體的慢性疾病甚至癌癥起到一定的治療作用。

    螺旋藻蛋白;肽;細胞因子;信號途徑;植物非營養(yǎng)成分

    20世紀80年代以來,膳食纖維中的植物非營養(yǎng)成分(phytochemicals)也叫植物營養(yǎng)素,已經(jīng)成為一個熱門議題,有數(shù)十類不同化學結構的植物非營養(yǎng)成分已經(jīng)被鑒定出來,包括類胡蘿卜素、植物固醇、皂苷、多酚、植物雌激素類等。許多體外實驗表明植物營養(yǎng)素都有抗癌,抗氧化,降低膽固醇,抑制腸道病原菌[1],抑制炎癥反應,調節(jié)免疫的作用,體內(nèi)研究暫未形成趨勢。螺旋藻作為一種營養(yǎng)豐富的保健品含有多糖、維生素(VB族、β胡蘿卜素、亞油酸、亞麻酸)和大量的蛋白質。其中維生素成分已經(jīng)發(fā)揮了類似Phytochemicals的作用,而螺旋藻蛋白類對機體的作用途徑報道甚少,不過有研究表明,螺旋藻蛋白水解物通過對細胞因子水平的調節(jié),進而對機體免疫功能發(fā)揮著重要的調節(jié)作用。王連芬等[2-3]分別通過螺旋藻的胰蛋白酶酶解肽作用于小鼠和胃蛋白酶酶解肽作用于家兔后,比較口服灌胃、腹腔注射和靜脈注射3種給藥途徑對動物體內(nèi)細胞因子的影響,結果顯示腹腔注射結果最顯著,說明這些酶解肽是通過腸黏膜系統(tǒng)對細胞因子網(wǎng)絡起著調節(jié)作用的。本實驗使用堿性蛋白酶對提取出的螺旋藻蛋白進行酶解,將其酶解物用家兔通過灌胃、腹腔注射、耳靜脈注射3種給藥方式,檢測其血清中IL-1 β、IL-6、IL-12、IFN-γ、TNF-α、IL-1Ra、IL-4、IL-10和TGF-β各自的質量濃度變化情況,探索螺旋藻蛋白酶解肽對細胞因子可能發(fā)揮的調節(jié)作用和作用途徑,從而推測螺旋藻堿性蛋白酶解肽對機體產(chǎn)生的免疫功能。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    大耳白兔(雌性,清潔級,17~18周齡,2~3kg/只)購自天津市津南區(qū)實驗動物養(yǎng)殖場。螺旋藻(Spirulina)粉購于內(nèi)蒙古鄂托克旗烏蘭鎮(zhèn)。

    牛血清白蛋白BSA(電泳純98%) 中國醫(yī)學科學院血研所;堿性蛋白酶(Alkali protease,酶活力為3000U/g)天津華生生物科技有限公司;家兔血清ELISA IL-1β、IL-6、IL-12、IFN-γ、TNF-α、IL-1Ra、IL-4、IL-10和TGF-β試劑盒 尚柏生物醫(yī)學技術(北京)有限公司。1.2儀器與設備

    752型紫外-可見光分光光度計 上海精密科學儀器有限公司;J2-21型高速冷凍離心機 貝克曼儀器公司;SD-1000噴霧干燥機 日本東京理化器械株式會社;3K15高速冷凍離心機 德國西格馬實驗離心機有限公司;DL-6000B低速離心機 上海安亭科學儀器廠;FD-1型冷凍干燥機 鄭州長城科工貿(mào)有限公司;Mutiskan MK3酶標儀 上海雷勃分析儀器有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1 螺旋藻蛋白酶解肽的制備

    稱取25g螺旋藻粉,按1:20(m/V)加入500mL蒸餾水溶解,充分緩慢攪拌均勻,將溶解液在-20℃冷凍,4℃融解,反復凍融3~4次并進行超聲波破碎,所得的細胞懸液用低速離心機離心,取上清液。將上清液加入飽和硫酸銨溶液,充分攪拌過夜沉淀蛋白,再次冷凍離心,棄去上清液[4]。重復多次。沉淀加入少量生理鹽水溶解,進行透析,得到螺旋藻蛋白,凱式定氮法測定螺旋藻蛋白總含氮量,考馬斯亮藍法測定水溶性蛋白質量濃度[5],則蛋白提取率達52.46%。對提取的蛋白溶液噴霧干燥的蛋白干粉,加入定量的水,配成7g/100mL的蛋白底物溶液,以堿性蛋白酶:底物質量比為1:30、pH1.75、50℃條件下充分酶解2h[6]。所得的酶解液進行超濾,截留相對分子質量6000以下的多肽混合物,將其冷凍干燥制成干粉以備用。

    1.3.2 動物分組及處理

    用上述方法制得的多肽混合物干粉,配成質量濃度為1.5g/100mL的溶液。將家兔進行隨機分組,每個大籠中的白兔分別進行分組。每組4只,共3組,分別為螺旋藻蛋白水解物耳靜脈注射組、螺旋藻蛋白水解物腹腔注射組、螺旋藻蛋白水解物口服組,給藥量分別為6、12、30mg/kg bw[7];空白對照組3組,每組4只,分別為耳靜脈注射生理鹽水對照組、腹腔注射生理鹽水對照組與口服生理鹽水對照組,給藥量和相應實驗組用同等劑量,實驗前一天給家兔禁食。3種給藥方式分別在給藥2、2、3h[8]后從家兔耳靜脈取血,置于4℃過夜,次日4000r/min冷凍離心20min,得到血清。將采集的血清2~8℃的冰箱內(nèi)保存以備用家兔血清中細胞因子濃度的測定

    1.3.3 家兔血清中細胞因子質量濃度的測定

    采用ELISA雙抗夾心法嚴格按試劑盒說明操作,檢測家兔血清IL-1β、IL-6、IL-12、IFN-γ、TNF-α、IL-1Ra、IL-4、IL-10和TGF-β水平[9-10]。

    1.4 數(shù)據(jù)處理

    應用SPSS11.5統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計學分析。數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標準差表示,各組均數(shù)的比較采用方差分析,P<0.05有顯著性差異,P<0.01有極顯著性差異。所有柱形圖應用Graphpad Prism繪制。

    2 結果與分析

    2.13 種給藥方式對IL-1β的影響

    從圖1可看出,口服灌胃和靜脈注射兩種方式,IL-1β質量濃度均有所上升,但變化不具顯著性,而腹腔注射組IL-1β的質量濃度下降極其顯著。

    圖1 3種給藥方式對IL-1β的影響Fig.1 Effect of three administration routes on IL-1β

    2.23 種給藥方式對IL-6的影響

    圖2 3種給藥方式對IL-6的影響Fig.2 Effect of three administration routes on IL-6

    由圖2可知,腹腔和靜脈兩種注射方法條件下IL-6的質量濃度都有所下降,其中腹腔注射效果相當顯著,口服灌胃組IL-6的質量濃度稍有升高。說明,螺旋藻蛋白對IL-6的調節(jié)作用可能是通過血液以及黏膜系統(tǒng)發(fā)揮的。

    2.33 種給藥方式對IL-12的影響

    圖3 3種給藥方式對IL-12的影響Fig.3 Effect of three administration routes on IL-12

    由圖3可知,3種給藥方式下,腹腔注射組最顯著,而且IL-12水平均有所下降,說明螺旋藻蛋白酶解肽對于IL-12的調節(jié)作用可能是通過腸黏膜系統(tǒng)發(fā)揮作用的。

    2.43 種給藥方式對IFN-γ的影響

    由圖4可知,3種方式均顯示出血清中IFN-γ質量濃度有一定程度的升高,但都沒有顯著性變化。

    圖4 3種給藥方式對IFN-γ的影響Fig.4 Effect of three administration routes on IFN-γ

    2.53 種給藥方式對TNF-α的影響

    圖5 3種給藥方式對TNF-α的影響Fig.5 Effect of three administration routes on TNF-α

    由圖5可知,腹腔注射方式使TNF-α在血清中的質量濃度降低,口服組和靜脈注射組中TNF-α質量濃度有微量上調。

    2.63 種給藥方式對IL-1Ra的影響

    圖6 3種給藥方式對IL-1Ra的影響Fig.6 Effect of three administration routes on IL-1Ra

    由圖6可知,口服灌胃和腹腔注射兩種注射方式下IL-1Ra的質量濃度都有所升高,尤其是腹腔注射效果更顯著,而靜脈注射組僅有略微降低。

    2.73 種給藥方式對IL-4的影響

    由圖7可知,口服灌胃方式下IL-4質量濃度有所下降,其余兩種方式下其質量濃度都升高,尤其是腹腔注射方式變化相當顯著,說明,螺旋藻蛋白對IL-6的調節(jié)作用可能是通過血液以及黏膜系統(tǒng)發(fā)揮的。

    圖7 3種給藥方式對IL-4的影響Fig.7 Effect of three administration routes on IL-4

    2.83 種給藥方式對IL-10的影響

    圖8 3種給藥方式對IL-10的影響Fig.8 Effect of three administration routes on IL-10

    由圖8可知,將螺旋藻堿性蛋白酶酶解肽以口服灌胃、靜脈注射和腹腔注射方式進入家兔體內(nèi),其IL-10水平稍有上升,變化均不顯著。

    2.93 種給藥方式對TGF-β的影響

    圖9 3種給藥方式對TGF-β的影響Fig.9 Effect of three administration routes on TGF-β

    由圖9可知,TGF-β的質量濃度除在腹腔注射條件下有所下降,在其他兩種給藥方式中均有小幅度上升。

    3 討 論

    表1 螺旋藻蛋白的堿性蛋白酶解肽對家兔細胞因子的影響Table 1 Effects of peptides fromSpirulinaprotein hydrolyzed by alkali protease on cytokines in rabbits

    如表1所示,3種方式給藥后,家兔血清中細胞因子變化情況有所不同。3個實驗組與正常生理鹽水組相比,IL-12質量濃度均下降,IFN-γ、IL-10質量濃度均升高;在3種給藥方式中腹腔注射效果最顯著,其他兩種方式作用家兔后細胞因子水平均沒有顯著性變化。腹腔注射組中炎癥細胞因子IL-1β、IL-6、IL-12、TNF-α的質量濃度均顯著性降低,抗炎細胞因子IL-1Ra和IL-4顯著性升高,IFN-γ、IL-10和TGF-β變化不顯著。

    免疫細胞和非免疫細胞分泌的細胞因子可以作用于其他細胞的受體,在分子水平上調節(jié)多種細胞生理功能[11](表2)。它們和相應的靶細胞外膜上的受體結合,依賴于細胞和所作用的細胞因子產(chǎn)生某種應答。而且經(jīng)常是靶細胞在細胞因子的刺激下產(chǎn)生另外的細胞因子。它們主要作為細胞間的信號傳遞分子,介導和調節(jié)機體免疫應答、細胞分化、造血、腫瘤免疫等多種生理及病理過程??傊?,細胞因子是一個復雜的網(wǎng)絡系統(tǒng),機體免疫應答的發(fā)生發(fā)展,進而發(fā)炎細胞因子和抗炎細胞因子之間相互作用和相互平衡[12]。

    表2 幾種顯著變化的細胞因子對免疫細胞的作用功效Table 2 Effects of cytokines with an obvious change on immune cells

    本實驗通過3種給藥方式,即口服灌胃、腹腔注射和靜脈注射,不同給藥途徑螺旋藻堿性蛋白酶酶解肽

    對細胞因子的作用強度有所不同??诜辔负透骨蛔⑸浣M中腸黏膜免疫系統(tǒng)起主要作用。

    口服灌胃組:螺旋藻酶解肽經(jīng)過胃腸道消化成更小的短肽,作為外來抗原經(jīng)腸黏膜上皮細胞、樹突細胞和其他抗原呈遞細胞進行抗原加工、處理和呈遞,激活細胞內(nèi)部的炎癥信號。這些短肽可能會與一些細胞(如DC細胞和上皮細胞)的模式識別受體PRRs結合產(chǎn)生激活發(fā)炎細胞因子的信號,如與G蛋白偶聯(lián)受體通過激活PKC/NF-κb途徑使IL-1β,經(jīng)PKC/MAPK途徑激活IFN-γ、IL-6和TNF-α。腸道內(nèi)皮細胞暴露于一定的致炎細胞因子如IFN-γ而顯著促進CD40的表達,CD40通過調節(jié)非受體型酪氨酸蛋白激酶,如Lyn、Fyn、Syk等的活性,活化PI3K、Rel/NF-Kb轉錄因子,誘導炎癥細胞因子產(chǎn)生。炎癥信號的持續(xù)產(chǎn)生也會激活抗炎細胞因子的基因表達。

    腹腔注射組:未經(jīng)消化的螺旋藻酶解肽直接注射腹腔首先會通過上皮細胞介導的胞吞作用穿過腸黏膜屏障,被單核/巨噬細胞、NK細胞肥大細胞等先天免疫細胞所識別,促進發(fā)炎細胞因子的產(chǎn)生,隨著時間的延長及外源物刺激的消失,抗炎細胞因子濃度會升高如IL-1Rα、IL-10和IL-4,IL-4/STAT6和IL-10/ STAT5、6使Th0分化成Th2細胞促進細胞免疫,IL-1Rα能抑制巨噬細胞、NK細胞的殺傷作用以及IL-1β、IL-6和IL-12的表達,IL-12濃度的降低也會通過抑制其介導的STAT4途徑而抑制Th1細胞的分化。所以實驗結果顯示腹腔注射螺旋藻蛋白酶解肽2h后起到了抗炎作用。

    靜脈注射組的給藥方式是避開腸胃道及黏膜系統(tǒng)直接進入血液作用于家兔的。從靜脈注射結果看,螺旋藻堿性蛋白酶酶解肽可能作為外周血白細胞上G蛋白偶聯(lián)受體激活PKC途徑或者TLR配體激活TLR-4和TLR-5/ 7/8/9[13],進而激活NF-κB或經(jīng)MAPK途徑誘導炎癥細胞因子的產(chǎn)生[14]如 IL-1、INF-γ,而IL-1β作為巨噬細胞的第二信使,能促使Th1細胞產(chǎn)生IL-2,IL-2能夠與外周血單核細胞上IL-2R結合通過MAPK途徑釋放INF-γ和TNF-α。而炎癥細胞因子的持續(xù)升高又會激活抗炎細胞因子基因IL-1Rα和IL-4的轉錄,血液中持續(xù)產(chǎn)生的IL-4能通過激活STAT6途徑促使Th2細胞分化,激發(fā)細胞免疫,產(chǎn)生更多的IL-10和TGF-β,這些抗炎細胞因子繼續(xù)抑制巨噬細胞表達IL-12、IL-6等細胞因子。

    可見,細胞因子之間的相互調節(jié)是很復雜的,它們的相互作用在腸黏膜系統(tǒng)連接先天免疫和獲得性免疫中起了重要的作用。從以上圖1~9可以看出,腹腔注射效果最為顯著,如IL-1β、IL-6、IL-12、TNF-α、IL-1Ra及IL-4,它們在腹腔注射方式下和相應的生理鹽水組相比質量濃度變化極為顯著。由于腹腔內(nèi)的共同黏膜免疫系統(tǒng)(common mucosal immunity system,CMIS)的存在[15-16],腸道上皮細胞(M細胞)、淋巴細胞、巨噬細胞、抗原呈遞細胞、NK細胞等在受到螺旋藻蛋白酶解肽刺激后,各種信號識別系統(tǒng)識別多肽的有效成分,產(chǎn)生一系列相應的細胞因子,如本研究中的IL-6、INF-γ等,它們能夠招募和活化其他免疫細胞或炎性細胞,與相應的受體結合并發(fā)出感染的信號,準確及時地傳遞給上皮細胞。接著,胞內(nèi)一系列轉錄因子磷酸化和去磷酸化使這些細胞因子的信號被放大(表3),吸引和活化大量的炎性細胞聚集到效應部位。也就是說,螺旋藻堿性蛋白酶酶解肽可能是通過黏膜免疫誘導或抑制發(fā)炎或抗炎細胞因子間相互協(xié)同、拮抗等構成的一個復雜的細胞因子網(wǎng)絡,通過這一復雜的細胞因子網(wǎng)絡調節(jié)機體的免疫狀態(tài),對外來的入侵者進行“斗爭”,并可以抑制過頭的免疫應答,從而控制先天或獲得性免疫活性,最終使機體保持健康狀態(tài)。由此可以看出,黏膜系統(tǒng)在螺旋藻蛋白酶解肽的調節(jié)過程中發(fā)揮了十分重要的作用,腸黏膜不僅是吸收營養(yǎng)物質的關鍵,也是食物和黏膜免疫系統(tǒng)相互作用的場所,更是調節(jié)機體免疫和生理狀態(tài)的關鍵。

    本研究初步闡明了螺旋藻堿性蛋白酶酶解肽可主要是通過腹腔給藥途徑調節(jié)細胞因子及其網(wǎng)絡來調節(jié)機體的免疫功能。可以進一步測定更多的白介素類細胞因子、趨化因子以及核因子的變化情況找出螺旋藻蛋白酶酶解肽進入體內(nèi)的作用途徑,以及利用等離子共振成像技術找出螺旋藻酶解肽在細胞上的受體。

    表3 細胞因子產(chǎn)生和介導的信號途徑Table 3 Production and signaling pathways of cytokines

    4 結 論

    3種給藥方式中腹腔注射方式對機體細胞因子表達的作用最明顯,炎癥細胞因子IL-1β、IL-6、IL-12、TNF-α的質量濃度都顯著下降,抗炎細胞因子IL-1Ra和IL-4的質量濃度顯著升高,可見腸黏膜系統(tǒng)對螺旋藻蛋白酶解肽信號途徑的傳遞主要是通過抑制NF-κB和PKC/ p38/MAPK途徑來降低免疫的。這與植物非營養(yǎng)物質能

    夠通過抑制轉錄因子NF-κB活性抑制炎癥信號級聯(lián)的作用機制相一致,說明螺旋藻的短肽類成分也可以進入體內(nèi)對機體的慢性疾病甚至癌癥起到一定的治療作用。

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    Effects of Peptides Derived from Spirulina Protein on Mucosal Immune System in Rabbits

    LIU Xiao-juan1,PANG Guang-chang1,*,WANG Lian-fen1,2
    (1. Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology, College of Biotechnology and Food Science, Tianjin University of Commerce, Tianjin 300134, China;2. China Food Publishing Company, Beijing 100050, China)

    Objective: To explore the effects of peptides derived from Spirulina protein hydrolyzed by alkali protease on mucosal immune system in rabbits. Methods: Protein was extracted from Spirulina by salting out method, and then hydrolyzed with alkaline protease. The rabbits were treated with the hydrolysate by intragastric administration, intraperitoneal injection and ear vein injection, respectively. At 3, 2 and 2 h after administration, ELISA kit was used to determine the concentration changes of IL-1β, IL-6, IL-12, IFN-γ, TNF-α, IL-1Ra, IL-4, IL-10 and TGF-β in rabbit serum. Results: Compared with the control group treated with physiological saline, all the three administration route groups showed a notable decrease in the concentration of IL-12 but an increase in both the concentrations of IFN-γ and IL-10. However, on the basis of the comparison among the three administration routes, intraperitoneal injection revealed the most remarkable change in cytokines; in contrast, the two others had no obvious change. In the intraperitoneal injection group, the concentrations of IL-1β, IL-6, IL-12 and TNF-α revealed a significant decrease, while those of IL-1Ra and IL-4 exhibited a dramatic increase, which suggests that the peptides derived from Spirulina protein hydrolyzed by alkali protease have strong immune activity. Conclusion: The immune signaling transduction of Spirulina peptides in mucosal immune system is completed by inhibiting NF-κ B and PKC/p38/MAPK pathways in mucosal epithelium, endothelial cell, monocytes/macrophages and lymphocytes, which is similar to the phytochemical mechanism for inhibiting NF-κ B and inflammatory reaction.

    Spirulina protein;peptides;cytokine;signal pathway;phytochemicals

    Q178.535

    A

    1002-6630(2010)21-0378-06

    2010-07-06

    劉小娟(1986—),女,碩士研究生,研究方向為生物活性物質的提取與分離。E-mail:llxjj1236@163.com

    *通信作者:龐廣昌(1956—),男,教授,博士,研究方向為食品生物技術及食品免疫學。E-mail:pgc@tjcu.edu.cn

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