銀條多酚氧化酶特性及控制的研究

郭香鳳

銀條多酚氧化酶特性及控制的研究

郭香鳳

(河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽 471003)

對(duì)銀條多酚氧化酶(PPO)的酶學(xué)特性及控制進(jìn)行研究。結(jié)果表明：銀條PPO的最適反應(yīng)時(shí)間為2.0min，最適pH值為5.0，最適溫度為30℃，銀條PPO的熱穩(wěn)定性較差。抗壞血酸(VC)、L-半胱氨酸(L-cys)、亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉等對(duì)PPO活性均有極顯著地抑制作用；在0.05g/100mL 檸檬酸+0.05g/100mL 抗壞血酸+0.05g/100mL L-半胱氨酸復(fù)合化學(xué)抑制劑作用條件下，對(duì)銀條PPO的酶活性抑制率可達(dá)93.5%。

銀條；多酚氧化酶；酶活力；抑制率；控制

銀條是河南省偃師市的名優(yōu)地方特產(chǎn)蔬菜，以其色白、質(zhì)脆、口味清香等優(yōu)良品質(zhì)而深受國內(nèi)外消費(fèi)者的喜愛。然而銀條采后貯藏和加工過程中的褐變是影響其商品品質(zhì)和制約其經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重要因素，這與多酚氧化酶(PPO)催化的酶促反應(yīng)有關(guān)。尋求抑制PPO活性的有效措施一直是PPO研究的熱點(diǎn)之一[1]。對(duì)馬鈴薯[2]、花椰菜[3]、蓮藕[4]、雪梨[5]、芋艿[6]、大蒜[7]、茄子[8]、蘋果[9]、山藥[10]等多種植物組織PPO的酶學(xué)特性研究表明：不同植物組織的PPO性質(zhì)因植物種類、品種、酶促反應(yīng)條件及各種化學(xué)物質(zhì)影響的不同而異[11]。但有關(guān)銀條PPO特性的研究尚未見報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)以新鮮銀條為材料，對(duì)其PPO的酶學(xué)特性及控制措施進(jìn)行研究，探討其酶促反應(yīng)基本條件以及不同抑制劑對(duì)其活性的影響，以期有效控制銀條采后貯藏和加工過程中的褐變和商品品質(zhì)，為進(jìn)一步擴(kuò)大銀條的生產(chǎn)規(guī)模、提高貯藏和加工品質(zhì)、延長銀條產(chǎn)品的貨架壽命等提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮銀條采自河南省偃師市，當(dāng)日采收后立即運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室處理備用。

檸檬酸(CA)、抗壞血酸(VC)、L-半胱氨酸(L-cys)、亞硫酸鈉(Na2SO3)、亞硫酸氫鈉(NaHSO3)、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)等均為分析純，食鹽(NaCl)為食品級(jí)。

1.2 儀器與設(shè)備

722-S型分光光度計(jì) 上海市精密科學(xué)儀器有限公司；EPH522酸度計(jì) 上海宇隆儀器有限公司；KDC-16H高速離心機(jī) 科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司；HH-W420數(shù)顯三用恒溫水箱 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；202型電熱恒溫干燥箱 北京市永光明醫(yī)療儀器廠；BS-200S電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司。

1.3 方法

1.3.1銀條中PPO粗酶液的提取

參照趙玉宏[10]的方法略加改進(jìn)。將新鮮銀條洗凈、瀝干、沾凈水分后，隨機(jī)取30g樣品，加入約10mL預(yù)冷后的pH7.0磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，冰浴研磨至勻漿后，全部轉(zhuǎn)移至100mL棕色容量瓶中定容，于4℃冰箱中靜置提取15min后，過濾，濾液于4℃、8000r/min條件下離心20min，上清液即為銀條PPO粗酶液，于4℃冰箱中貯藏備用。

1.3.2 銀條PPO基本特性的測(cè)定

1.3.2.1 銀條PPO最大吸收波長

參考高愿軍等[4]的方法，將酶與鄰苯二酚的反應(yīng)產(chǎn)物在380～450nm波長范圍內(nèi)掃描，確定銀條PPO的最大吸收波長為410nm。

1.3.2.2 銀條PPO活性

以鄰苯二酚為底物，在3.0mL反應(yīng)體系中，加入2.7mL最適pH值的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液和0.2mL 0.1mol/L鄰苯二酚、0.1mL銀條PPO粗酶液，于最適溫度下保溫一定時(shí)間后立即于最大吸收波長處測(cè)定反應(yīng)產(chǎn)物的OD值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。以O(shè)D值表示銀條PPO的相對(duì)酶活力[12]。

1.3.2.3 銀條PPO反應(yīng)進(jìn)程曲線的繪制

參照1.3.2.2節(jié)的方法，室溫(14℃)下分別在1.0～10.0min范圍內(nèi)(間隔1.0min)測(cè)定PPO的OD值，繪制出PPO反應(yīng)進(jìn)程曲線。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.2.4 pH值對(duì)銀條PPO活性的影響

在3.0mL反應(yīng)體系中分別加入2.7mL pH值為2.0～8.0 (間隔1.0)的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液，在室溫(14℃)下反應(yīng)2.0min測(cè)定其OD值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.2.5 溫度對(duì)銀條PPO活性的影響

將反應(yīng)液分別在20～50℃(間隔5℃)恒溫條件下反應(yīng)2.0min后，測(cè)定其OD值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.2.6 銀條PPO熱穩(wěn)定性的測(cè)定

在3.0mL反應(yīng)體系中加入2.7mL pH5.0磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液和0.1mL銀條PPO粗酶液，將混合液置于90℃水浴中，分別加熱0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0min后立即冷卻至30℃，加入0.1mL 0.1mol/L鄰苯二酚反應(yīng)2.0min后測(cè)定OD值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.2.7 酶添加量對(duì)銀條PPO活性的影響

分別在3.0mL反應(yīng)體系中加入0.1、0.2、0.3、0.4mL銀條PPO粗酶液反應(yīng)后，測(cè)定其OD值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.3 不同抑制劑對(duì)銀條PPO活性的影響

參照1.3.2.2節(jié)的方法，分別在3.0mL反應(yīng)體系中加入0.2mL不同質(zhì)量濃度的CA、L-cys、NaCl、VC、Na2SO3、NaHSO3、EDTA-2Na等抑制劑反應(yīng)后，測(cè)定其處理后的殘留酶活性。用去離子水作對(duì)照，以相對(duì)抑制率[13]為指標(biāo)，進(jìn)行抑制效果的比較和較優(yōu)抑制劑水平的選擇。然后選擇其中抑制效果較好的VC、L-cys配合成本較低的CA進(jìn)行三因素三水平正交試驗(yàn)，篩選最優(yōu)抑制劑組合。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均采用DPS v7.05軟件統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

圖1 銀條PPO反應(yīng)時(shí)間進(jìn)程曲線Fig.1 Time course of hydrolysis catalyzed by PPO fromStachys floridanaSchuttl.ex Benth

2.1 銀條PPO反應(yīng)時(shí)間進(jìn)程曲線如圖1所示，反應(yīng)最初2.0min內(nèi)酶活力變化很快，2.0min時(shí)酶活力達(dá)到最大值0.703，以后隨著反應(yīng)進(jìn)程的進(jìn)行，反應(yīng)速度快速下降，可能與酶反應(yīng)產(chǎn)物積累對(duì)酶的抑制有關(guān)。故本試驗(yàn)選擇2.0min作為銀條PPO最適反應(yīng)時(shí)間。銀條PPO的時(shí)間反應(yīng)曲線提示：在貯藏和加工實(shí)踐中，應(yīng)在銀條組織和細(xì)胞遭到破壞(如加工中高壓水清洗造成的銀條表皮破損和斷條造成的傷口等)的同時(shí)快速采取措施才能有效地抑制酶促褐變的發(fā)生。

2.2 pH值對(duì)銀條PPO活性的影響

圖2 pH值對(duì)銀條PPO活性的影響Fig.2 Effect of pH on the activity of PPO fromStachys floridanaSchuttl.ex Benth

如圖2所示，在pH2～8不同酸堿條件下，銀條PPO活性差別較大。pH≤4.0酸性范圍內(nèi)，隨pH值升高銀條PPO活力急劇升高，pH2.0時(shí)酶活力僅為最適pH值

時(shí)的9.28%，表明酸對(duì)其活性的影響較大，生產(chǎn)上可以考慮通過加酸處理來抑制銀條PPO的活性；當(dāng)pH值達(dá)到5.0時(shí)酶活力升至高峰，由此判斷其最適pH值為5.0。當(dāng)pH≥6.0時(shí)，隨pH值的繼續(xù)升高，PPO活性逐漸降低。這種酶在酸堿條件下活性的變化，與其含銅蛋白有關(guān)；在pH值較低的酸性環(huán)境中，酶活性中性中的銅被解離出來，使酶活性降低，而在堿性條件下銅會(huì)解離形成氧化銅，使酶活性下降[8,14]。故本試驗(yàn)選擇pH5.0為銀條PPO最適pH值。

作為地下根莖類蔬菜，銀條PPO的最適pH值與紫甘薯[15](最適pH4.1和6.0)、普通甘薯[16](最適pH4.4和6.4)、蓮藕[4](最適pH7.0)、淮山藥[13](最適pH6.0)、葛根[17](最適pH7.0)等有所不同。

2.3 溫度對(duì)銀條PPO活性的影響

圖3 溫度對(duì)銀條PPO活性的影響Fig.3 Effect of temperature on the activity of PPO fromStachys floridanaSchuttl.ex Benth

如圖3所示，在20～50℃范圍內(nèi)，30℃時(shí)銀條PPO的反應(yīng)活性最高，此后隨溫度的繼續(xù)升高，酶活力急劇下降，表明銀條PPO對(duì)溫度反應(yīng)敏感，生產(chǎn)上可以通過控制反應(yīng)溫度有效地控制酶促褐變[8]。

2.4 酶添加量對(duì)銀條PPO活性的影響

圖4 加酶量對(duì)銀條PPO活性的影響Fig.4 Effect of enzyme loading on the activity of PPO fromStachys floridanaSchuttl.ex Benth

如圖4所示，銀條PPO活性與粗酶液添加量呈正相關(guān)，隨加酶量的增加而顯著升高(P＜0.05)。考慮到OD的取值范圍，本試驗(yàn)選擇0.1mL為最適加酶量。

2.5 銀條PPO的熱穩(wěn)定性

如圖5所示，在9 0℃恒溫加熱處理?xiàng)l件下，隨著加熱時(shí)間的延長，銀條PPO活性極顯著地下降(P＜0.01)，表明其熱穩(wěn)定性較差。加熱0.5min時(shí)酶活力下降了29%，加熱3min時(shí)，酶活力急劇下降至原來的29.3%；其后隨加熱時(shí)間的繼續(xù)延長，酶的活性基本趨于穩(wěn)定，加熱5min時(shí)對(duì)酶活的抑制率達(dá)到75.4%。表明加熱可以極顯著地鈍化銀條PPO的活性，但不能徹底抑制酶的作用，且新鮮銀條質(zhì)地脆嫩、組織結(jié)構(gòu)疏松，長時(shí)間加熱易引起質(zhì)地軟爛影響成品口感和形狀，故銀條加工中在進(jìn)行短時(shí)熱處理(燙漂)的同時(shí)需要輔助其他措施來加強(qiáng)酶促褐變抑制效果。

圖5 熱處理對(duì)銀條PPO活性的影響Fig.5 Effect of thermal treatment on the activity of PPO fromStachys floridanaSchuttl.ex Benth

2.6 不同抑制劑對(duì)銀條PPO活性的影響

表1 不同抑制劑對(duì)銀條PPO活性抑制作用比較Table 1 Comparison on inhibition effects of different inhibitors on the activity of PPO fromStachys floridanaSchuttl.ex Benth

CA、VC、L-cys、EDTA-2Na、Na2SO3、NaHSO3、NaCl幾種常用化學(xué)物質(zhì)對(duì)銀條PPO酶活抑制結(jié)果見表1。由表1可知，本試驗(yàn)所篩選的幾種化學(xué)物質(zhì)對(duì)銀條PPO活性均有一定的抑制作用，以Na2SO3、NaHSO3、VC和L-cys四種常用抑制劑對(duì)銀條PPO的抑制能力較強(qiáng)；而CA、NaCl、EDTA-2Na這3種物質(zhì)的抑制能力相對(duì)較弱。

鑒于使用亞硫酸鹽類存在一些產(chǎn)生異味、破壞營養(yǎng)、影響哮喘病人健康等弊端而被限制使用[17]，而CA中羰基可與多酚氧化酶的銅離子產(chǎn)生比較強(qiáng)的螯合作用[13]、VC既可作為PPO的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑又可氧化漂白色素[18]、L-cys[19]能夠與酶促反應(yīng)產(chǎn)物醌類結(jié)合從而抑制酶促褐變，因此，生產(chǎn)上可以考慮采用VC、L-cys、CA等取代硫處理而作為控制銀條酶促褐變的化學(xué)抑制劑使用。

2.7 銀條PPO抑制劑正交試驗(yàn)

在上述單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇VC、L-cys、CA為因素進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，尋求各因素之間的協(xié)同抑制效應(yīng)。試驗(yàn)結(jié)果見表2～4。

表2 銀條PPO抑制劑正交因素水平表Table 2 Factors and levels in orthogonal array design for optimizing formulation of a compound inhibitor for PPO fromStachys floridanaSchuttl.ex Benth

表3 正交試驗(yàn)極差分析Table 3 Range analysis for orthogonal array experimental results

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 4 Variance analysis for orthogonal array experimental results

由表3可知，各因素對(duì)銀條PPO活性抑制強(qiáng)弱順序?yàn)椋嚎箟难幔緳幟仕幔綥-半胱氨酸。且抑制作用均達(dá)到極顯著水平(P＜0.01)(表4)。

根據(jù)極差分析結(jié)果(表3)，以各抑制劑因素組合對(duì)銀條PPO酶活力抑制的OD值較小者為最佳水平，得到的較優(yōu)組合為A3B3C3，考慮到降低成本的需要，在VC、L-cys水平不變、對(duì)PPO的抑制能力達(dá)到90%以上的前提下，將其與正交組合中抑制效果最好的組合A1B3C3進(jìn)行比較實(shí)驗(yàn)，A3B3C3組合處理后銀條PPO酶反應(yīng)的平均OD410nm值為0.046，略低于A1B3C3處理的(0.048)，但兩者之間差異不顯著，故本試驗(yàn)選擇A1B3C3為抑制劑最佳組合，即0.05g/100mL檸檬酸+0.05g/100mL抗壞血酸+0.05g/100mL L-半胱氨酸，此條件下對(duì)銀條PPO的酶活抑制率可達(dá)93.5%。

3 結(jié) 論

3.1 銀條PPO的最大吸收波長為410nm；最適反應(yīng)溫度為30℃；其最適反應(yīng)時(shí)間2.0min，隨反應(yīng)時(shí)間延長其酶活力下降，加工中應(yīng)在銀條高壓水清洗操作階段就應(yīng)開始護(hù)色處理；最適pH值為5.0，當(dāng)體系pH≤4.0或者pH≥6.0時(shí)，能有效降低銀條PPO活性。

3.2 銀條PPO的熱穩(wěn)定性較差，90℃恒溫加熱3.0min可使酶活下降至原來的29.3%；加熱5.0min時(shí)75.4%的酶活性喪失。故銀條加工中可以考慮將短時(shí)燙漂處理與其他抑制酶促褐變的措施相結(jié)合提高防褐變效果。

3.3 亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、抗壞血酸、L-半胱氨酸等常規(guī)化學(xué)抑制劑對(duì)銀條PPO活性有極顯著的抑制作用；可在0.05g/100mL檸檬酸+0.05g/100mL抗壞血酸+ 0.05g/100mL L-半胱氨酸的條件下對(duì)銀條PPO的酶活抑制率達(dá)到93.5%。

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Enzymatic Characterization and Inactivation of Polyphenol Oxidase from Stachys floridana Schuttl.ex Benth

GUO Xiang-feng
(College of Food and Bioengineering, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471003, China)

The enzymatic properties of polyphenol oxidase (PPO) extracted from Stachys floridana Schuttl.ex Benth were characterized. Meanwhile, the inactivation of this enzyme by thermal treatment or adding chemical inhibitors was investigated, and a compound inhibitor composed of three selected chemical inhibitors (citric acid, vitamin C and L-cysteine) was developed and its formulation was optimized. The optimal reaction pH, time and temperature conditions for PPO activity were 5.0, 2.0 min and 30 ℃, respectively. Color preserving agents such as ascorbic acid, L-cystenine, citric acid, NaHSO3, Na2SO3 had a significant inhibitory effect on PPO activity. The optimal combinatorial formula was composed of 0.05 g/100mL citric acid, 0.05 g/100mL vitamin C and 0.05 g/100mL L-cysteine, and the resultant enzyme inhibition rate reached up to 93.5%.

Stachys floridana Schuttl.ex Benth；polyphenol oxidase；PPO activity；inhibition rate；control

TS201.21

A

1002-6630(2010)21-0316-04

2010-06-11

郭香鳳(1964—)，女，副教授，碩士，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品保鮮加工。E-mail：gxfeng40@163.com