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    蘇丹紅Ⅲ對(duì)肌紅蛋白的熒光猝滅及分子模擬研究

    2010-03-21 07:24:20朱少萍蔡炳鋒
    食品科學(xué) 2010年21期
    關(guān)鍵詞:蘇丹紅肌紅蛋白殘基

    朱少萍,蔡炳鋒,毛 慧,趙 波,*

    蘇丹紅Ⅲ對(duì)肌紅蛋白的熒光猝滅及分子模擬研究

    朱少萍1,蔡炳鋒2,毛 慧2,趙 波2,*

    (1.常州工學(xué)院理學(xué)院,江蘇 常州 213002;2.江蘇省生物功能材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,南京師范大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院,江蘇 南京 210097)

    利用熒光光譜結(jié)合分子柔性對(duì)接模擬技術(shù)研究在模擬生理?xiàng)l件下蘇丹紅Ⅲ(Sudan Red Ⅲ)與肌紅蛋白(myoglobin,Mb)的作用機(jī)理。結(jié)果表明:蘇丹紅Ⅲ對(duì)Mb的熒光猝滅作用是由于二者之間形成復(fù)合物而導(dǎo)致的靜態(tài)猝滅,蘇丹紅Ⅲ與肌紅蛋白的表觀結(jié)合常數(shù)KA為7.13×103L/mol,結(jié)合位點(diǎn)數(shù)約為1;蘇丹紅Ⅲ與Mb分子的第一個(gè)活性口袋周圍的氨基酸殘基通過疏水作用、親水作用和氫鍵作用結(jié)合。蘇丹紅Ⅲ與Mb分子中的Trp、Tyr、Phe等氨基酸殘基之間的疏水相互作用,主要是與Phe33、Phe43 和 Phe138等之間的作用,導(dǎo)致了Mb的內(nèi)源熒光的靜態(tài)猝滅和最大發(fā)射峰的無序位移。

    蘇丹紅Ⅲ;肌紅蛋白;相互作用;熒光猝滅;分子模擬

    蘇丹紅是人工合成的偶氮類工業(yè)染料,包括蘇丹紅Ⅰ以及其衍生物蘇丹紅Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ。其中蘇丹紅Ⅲ(Sudan Red Ⅲ)化學(xué)名稱為1-[4-(苯基偶氮)苯基]偶氮-2-萘酚,結(jié)構(gòu)如圖1所示。由于蘇丹紅顏色鮮艷、價(jià)格低廉,常被一些非法企業(yè)用作食品染料。全球多數(shù)國家禁用蘇丹紅染料為食品添加劑[1-4]。早在1996年,我國《食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》中就明令禁止使用蘇丹紅為食品色素。

    圖1 蘇丹紅Ⅲ的分子結(jié)構(gòu)Fig.1 Molecular structure of Sudan redⅢ

    IARC將蘇丹紅Ⅲ列為三類致癌物,其初級(jí)代謝產(chǎn)物4-氨基偶氮苯被列為二類致癌物[1],此外,蘇丹紅能造成人體組織缺氧,引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)受損,甚至導(dǎo)致不孕[2-4],因此控制并檢測(cè)食品中的蘇丹紅有非常重要的意義。

    蘇丹紅Ⅲ對(duì)動(dòng)物的致突變性和致癌性與其代謝產(chǎn)物苯胺、萘酚的關(guān)系已經(jīng)得到廣泛研究[5-6], 而蘇丹紅Ⅲ與生物大分子的相互作用研究較少,采用分子模擬與光譜學(xué)實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的手段來研究其與動(dòng)物體內(nèi)蛋白質(zhì)如肌紅蛋白的的作用機(jī)理尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。

    肌紅蛋白(myoglobin,Mb)是哺乳動(dòng)物細(xì)胞,尤其是肌細(xì)胞貯存和分配氧的蛋白質(zhì)。肌紅蛋白由一條多肽鏈和一個(gè)血紅素輔基構(gòu)成,含153個(gè)氨基酸殘基,由于其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單且具有血紅素類蛋白的生物活性,而成為研究蛋白質(zhì)與其他分子相互作用的一種重要的模型蛋白[7]。

    本實(shí)驗(yàn)基于熒光猝滅的光譜學(xué)檢測(cè)手段,結(jié)合分子柔性對(duì)接模擬技術(shù)研究蘇丹紅Ⅲ與蛋白質(zhì)的相互作用的分子機(jī)理,這對(duì)于揭示蘇丹紅類化合物的毒性-結(jié)構(gòu)關(guān)系,實(shí)現(xiàn)基于分子結(jié)構(gòu)的毒性預(yù)測(cè),得出有類似毒化作用的化合物結(jié)構(gòu)有極其重要的作用。

    1 材料與方法

    1.1 材料、試劑與儀器

    蘇丹紅Ⅲ(Sudan Red Ⅲ,蘇丹紅Ⅲ儲(chǔ)備液是將0.0018g蘇丹紅Ⅲ溶解于無水甲醇中配制,濃度為1.0× 10-4mol/L) 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;無水甲醇 美國天地公司;馬心肌紅蛋白(Mb,用pH為7.4的Tris(三羥甲基甲烷)-HCl緩沖溶液,配制成1.0×10-5mol/L的儲(chǔ)備液,由于熒光實(shí)驗(yàn)是模擬人體條件下的反應(yīng),Tris-HCl 緩沖溶液中含有0.1mol/L NaCl 以維持離子強(qiáng)度,置于冰箱中保存) 美國Sigma公司;其他試劑均為分析純;實(shí)驗(yàn)中用水均為二次去離子水。

    Cary Eclipse型熒光光譜儀 美國Varian公司。

    1.2 熒光光譜的測(cè)定

    移取2mL Mb儲(chǔ)備液于1cm 的石英比色皿中,用微量注射器逐次加入不同量的蘇丹紅Ⅲ溶液,每次加入后混合均勻,使得蘇丹紅Ⅲ與Mb的濃度比分別是0、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4,靜置反應(yīng)完全后,在最大激發(fā)波長230nm進(jìn)行熒光掃描,記錄280~780nm 波長范圍內(nèi)的熒光光譜。

    1.3 分子模擬

    結(jié)合農(nóng)林院校的特點(diǎn)發(fā)揮農(nóng)林類院校的專業(yè)優(yōu)勢(shì),使學(xué)生在“生態(tài)文明”的建設(shè)中能掌握生態(tài)建設(shè)的相關(guān)理論與實(shí)踐方法,有針對(duì)性和差異性的培養(yǎng)學(xué)生的涉農(nóng)、涉林類基礎(chǔ)知識(shí),使學(xué)生在個(gè)人目標(biāo)的實(shí)現(xiàn)中,突出自身專業(yè)優(yōu)勢(shì)和知識(shí)結(jié)構(gòu)的差異,形成學(xué)生多元的文化基礎(chǔ)。

    分子力學(xué)與分子動(dòng)力學(xué)模擬采用美國Accelrys公司Discovery Studio 2.0(DS 2.0)軟件包完成,蘇丹紅 Ⅲ 分子的初始結(jié)構(gòu)由軟件包生成,Mb的晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)來自Brookhaven 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(Protein Data Bank Code: 1ymb)[8],依據(jù)軟件程序?qū)b中存在的空腔定義為活性口袋,取Mb活性口袋周圍的氨基酸殘基作為對(duì)接的受體,用Flexible Docking工具在CHARMm力場(chǎng)的作用下,將蘇丹紅Ⅲ分子作為配體柔性對(duì)接到受體Mb中,通過比較對(duì)接結(jié)果的Libdock Score來獲得最優(yōu)的蘇丹紅Ⅲ的穩(wěn)定構(gòu)象并進(jìn)行分子模擬。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 熒光光譜

    圖2 蘇丹紅Ⅲ和Mb混合溶液的熒光發(fā)射光譜Fig.2 Fluorescence spectrum of Sudan red Ⅲand Mb at different concentration ratios

    由圖2可知,隨著蘇丹紅Ⅲ濃度的增加,Mb在332nm波長處的最大發(fā)射峰的形狀沒有變化,而發(fā)射峰的強(qiáng)度逐漸降低,表明蘇丹紅Ⅲ使Mb的熒光發(fā)生了有規(guī)律的猝滅。Mb的內(nèi)源熒光主要來源于色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe)殘基。圖2顯示熒光最大發(fā)射峰的位置發(fā)生了無序位移,這可能是由于Mb在與不同濃度的蘇丹紅Ⅲ結(jié)合的過程中,對(duì)上述幾種熒光生色團(tuán)所處的微環(huán)境的影響不同,總的宏觀表現(xiàn)是無序的,其光譜性質(zhì)則表現(xiàn)為熒光最大發(fā)射峰的無序位移。

    2.2 熒光猝滅機(jī)理

    熒光物質(zhì)分子與溶劑分子或其他溶質(zhì)分子之間發(fā)生的,導(dǎo)致熒光強(qiáng)度下降的作用稱為熒光猝滅。對(duì)于動(dòng)態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅,Stem-Volmer方程為[9-11]:

    式中:F0和F分別是未加和加入猝滅劑時(shí)的熒光強(qiáng)度;Q為猝滅劑;KS和 KD分別為動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)和靜態(tài)猝滅常數(shù),忽略式(1)右邊的二次項(xiàng),則方程變?yōu)椋?/p>

    式(2)表明猝滅劑與F0/F之間存在線性關(guān)系,式中:KQ=(KS+ KD),τ0是未加入猝滅劑時(shí)熒光分子的平均壽命,生物大分子的τ0約為10-8s[12-14],Kq為熒光猝滅速率常數(shù)。由式(2)可知:

    根據(jù)圖2和式(2),做出相應(yīng)的Stern-Volmer圖(圖3)。

    圖3 蘇丹紅Ⅲ與Mb相互作用的Stern-Volmer曲線Fig.3 Stern-Volmer plot for the interaction of Sudan red III and Mb

    2.3 蘇丹紅Ⅲ和Mb結(jié)合位點(diǎn)數(shù)及表觀結(jié)合常數(shù)

    對(duì)于因猝滅劑與熒光分子之間的結(jié)合引起的靜態(tài)熒光猝滅,熒光物質(zhì)與猝滅劑之間的關(guān)系可由式(4)[16]推導(dǎo)出來:

    根據(jù)圖2和式(4)得到圖4,由直線的斜率和截距可以計(jì)算出蘇丹紅Ⅲ和Mb的表觀結(jié)合常數(shù)KA為7.13× 103L/mol,兩者之間具有較強(qiáng)的相互作用;結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n為0.773,說明蘇丹紅Ⅲ與Mb相互作用時(shí)近似形成1:1的復(fù)合物。

    2.4 分子模擬

    圖4 lg[(F0-F)/F]與lg[Q]的線性擬合曲線Fig.4 Fitting plot of lg[(F0-F)/F] vs. lg[Q]

    為了進(jìn)一步從理論上確定蘇丹紅Ⅲ與Mb鍵合的機(jī)理和模式,采用分子動(dòng)力學(xué)柔性對(duì)接的方法模擬兩者在真空狀態(tài)下相互作用的具體結(jié)合情況。依據(jù)DS2.0軟件包的分析,Mb分子中存在3個(gè)活性口袋。將蘇丹紅Ⅲ定義為配體,充分考慮了Mb活性口袋周圍氨基酸殘基的柔性,采用Flexible Docking 模塊與之對(duì)接,再采用分子動(dòng)力學(xué)模擬研究對(duì)接后的相互作用信息。為模擬人體條件,分子動(dòng)力學(xué)模擬過程中的Solvation計(jì)算也增加了補(bǔ)償離子Na+和Cl-。配體蘇丹紅Ⅲ經(jīng)柔性對(duì)接共獲得9種不同構(gòu)象,以程序中自帶的打分函數(shù)所得Libdock Score最高的構(gòu)象作為最優(yōu)的蘇丹紅Ⅲ對(duì)接構(gòu)象[17-18],并以此進(jìn)一步進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬。蘇丹紅Ⅲ-Mb復(fù)合物的最穩(wěn)定構(gòu)型如圖5所示。

    圖5 蘇丹紅Ⅲ與Mb的相互作用圖Fig.5 Molecular interaction between Sudan red Ⅲ and Mb

    由圖5可知,蘇丹紅Ⅲ與Mb的第一個(gè)活性口袋周圍的氨基酸殘基存在氫鍵、疏水、親水等作用。圖5A以線狀模式表示Mb分子的第一個(gè)活性口袋周圍的疏水氨基酸殘基,蘇丹紅Ⅲ分子中的苯環(huán)和萘環(huán)與T r p、Tyr、Phe等氨基酸殘基之間存在疏水相互作用,其中Phe33、Phe43 和 Phe138與蘇丹紅Ⅲ分子中的萘環(huán)較接近,產(chǎn)生了對(duì)接,這就很好地解釋了Mb內(nèi)源熒光靜態(tài)猝滅且無序位移的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,揭示了Mb熒光猝滅的分子機(jī)理。圖5A以球棒模式表示的是親水氨基酸殘基,共有3個(gè):His64、His93、His97。蘇丹紅Ⅲ分子中萘環(huán)上的鄰羥基容易與Mb中親水氨基酸組氨酸(His93)上的五元含氮雜環(huán)中的N(E2)之間形成親水作用。此外,蘇丹紅Ⅲ還與極性氨基酸殘基Lys42形成氫鍵作用,該氫鍵的鍵長為2.85A°,鍵角為159.7°。親水作用和氫鍵的形成也加快了電子轉(zhuǎn)移的速率,穩(wěn)定了蘇丹紅Ⅲ分子在活性口袋中的位置[19]。

    運(yùn)用Calculate Interaction Energy工具來計(jì)算對(duì)接之后蘇丹紅Ⅲ-Mb之間的結(jié)合能。結(jié)果顯示蘇丹紅Ⅲ和Mb相互作用的勢(shì)能是-1.702×103kJ/mol,進(jìn)一步說明蘇丹紅Ⅲ與Mb之間存在很強(qiáng)的相互作用。

    3 結(jié) 論

    實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明蘇丹紅Ⅲ是較強(qiáng)的猝滅劑,對(duì)Mb的內(nèi)源熒光的猝滅是由于二者之間形成了基態(tài)復(fù)合物。分子模擬揭示了它們相互作用的分子機(jī)理。蘇丹紅Ⅲ在Mb上的結(jié)合部位是Site 1活性口袋,蘇丹紅Ⅲ與其周圍的氨基酸殘基發(fā)生了疏水作用、親水作用和氫鍵作用。蘇丹紅Ⅲ與Mb分子中的Trp、Tyr、Phe等氨基

    酸殘基之間存在疏水相互作用,主要是與Phe33、Phe43和Phe138等之間的作用,導(dǎo)致了Mb的內(nèi)源熒光的靜態(tài)猝滅和最大發(fā)射峰的無序位移。

    蘇丹紅Ⅲ致畸、致癌、致突變的毒理可能是由于其與生物體蛋白中的某些具體氨基酸殘基發(fā)生強(qiáng)烈的作用,致使蛋白質(zhì)失去原有的活性或發(fā)生突變。本實(shí)驗(yàn)采用熒光光譜法結(jié)合分子模擬技術(shù)研究了模擬生理?xiàng)l件下人工合成工業(yè)染料蘇丹紅Ⅲ與肌紅蛋白相互作用的分子機(jī)理,確定了其作用位點(diǎn),揭示了分子水平上它們的精細(xì)作用信息,包括蘇丹紅Ⅲ的關(guān)鍵基團(tuán)和蛋白分子的有重要作用的氨基酸殘基。分子模擬技術(shù)能提供分子層次的作用情況,彌補(bǔ)實(shí)驗(yàn)手段的不足,對(duì)于揭示分子作用機(jī)理是一種十分有效的研究手段。這些研究對(duì)于揭示食品中的非法染料類添加劑在動(dòng)物體內(nèi)的代謝動(dòng)力學(xué)、毒性、毒性與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系,并實(shí)現(xiàn)基于分子結(jié)構(gòu)的毒性預(yù)測(cè),得出有類似毒化作用的化合物結(jié)構(gòu)都有著極其重要的作用。

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    Effect of Sudan Red III on Fluorescence Quenching of Myoglobin and Molecular Modeling of Their Interaction

    ZHU Shao-ping1,CAI Bing-feng2,MAO Hui2,ZHAO Bo2,*
    (1. School of Science, Changzhou Institute of Technology, Changzhou 213002, China;2. Jiangsu Key Laboratory of Biofunctional Materials, College of Chemistry and Materials Science, Nanjing Normal University, Nanjing 210097, China)

    The molecular interaction mechanism between Sudan red III and myoglobin (Mb) was investigated by fluorescence spectrum combined with molecular modeling under the mimic physiological conditions. Results showed that the fluorescence of Mb was quenched by Sudan red III due to the complex formation between them. This kind of fluorescence quenching was a static quenching. Molecular modeling revealed that Sudan red III could bind to the Site 1 of Mb. Hydrophobic interaction and hydrogen bond formation contribute to the binding of Sudan red III. The hydrophobic interaction and hydrophilic interaction between Sudan red III and Trp, Tyr, Phe residues in Mb resulted in static fluorescence quenching of Mb and disordered displacement of maximum emission peak. These interactions were focused on the residues of Phe33, Phe43 and Phe138 in Mb.

    Sudan red III;myoglobin;interaction;fluorescence quenching;molecular modeling

    TS202.3

    A

    1002-6630(2010)21-0165-04

    2010-08-02

    江蘇省科技廳自然科學(xué)基金項(xiàng)目(K2009407);上海市科委2010年度“科技創(chuàng)新行動(dòng)計(jì)劃”生物醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)科技領(lǐng)域重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目(10391901800)

    朱少萍(1971—),女,講師,碩士,主要從事有機(jī)分析、食品安全預(yù)警研究。E-mail:zhushaoping18@163.com

    *通信作者:趙波(1969—),男,教授,博士,主要從事食品安全預(yù)警和檢測(cè)研究。E-mail:zhaobo@njnu.edu.cn

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