蜂膠提取物中抑菌成分穩(wěn)定性研究

孟良玉，蘭桃芳，盧佳琨，張藝凡，初瑩瑩

蜂膠提取物中抑菌成分穩(wěn)定性研究

孟良玉，蘭桃芳，盧佳琨，張藝凡，初瑩瑩

(渤海大學生物與食品科學學院，遼寧省食品質量安全與功能食品重點實驗室，遼寧 錦州 121013)

對蜂膠提取物抑菌性能進行研究，同時以蠟樣芽孢桿菌為指示菌研究蜂膠提取物抑菌成分的穩(wěn)定性。結果表明：蜂膠提取物具有較強的抑菌活性，對熱處理、pH值、紫外線、金屬離子均具有較好的穩(wěn)定性，僅在121℃或pH10處理后其抑菌活性才明顯下降。

蜂膠；抑菌；穩(wěn)定性

食品防腐劑在延長食品貯藏期、保證食品品質的過程中具有非常重要的作用。傳統(tǒng)食品防腐劑以是化學合成品多見，由于化學合成的防腐劑可能存在毒性和致癌等一系列的問題，許多國家已逐步禁止或限制使用。國際上，食品添加劑正朝安全、無毒、天然方向發(fā)展。因此，篩選具有抑菌防腐活性的天然資源已發(fā)展成為食品行業(yè)新的研究領域。

蜂膠是蜜蜂從植物芽胞或樹干采集樹膠加工而成的，是用來修補巢房和內環(huán)境消毒殺菌的芳香性樹脂狀固體物質。早在公元前4世紀古希臘就將其作為治療創(chuàng)傷的良方[1]。近幾十年來，研究發(fā)現(xiàn)蜂膠具有極強的抗細菌、抗真菌、抗寄生蟲、抗病毒、抗腫瘤、調節(jié)人體免疫等豐富的藥理學作用，是開發(fā)新藥的巨大寶庫[2]。因此，20世紀中后期，在全世界范圍內出現(xiàn)了研究和應用蜂膠的熱潮，人們把蜂膠比作“紫色黃金”[3-4]。多種以蜂膠為重要活性成分的保健品，受到廣大消費者的青睞[5]。Kujumgiev等[6-8]報道了醫(yī)學上有關蜂膠抗菌、抗病毒作用。本研究在研究了蜂膠提取物抗菌性能的基礎上，進一步研究熱處理、pH值、紫外線、金屬離子對蜂膠提取物抑菌穩(wěn)定性的影響，為蜂膠開發(fā)成安全可靠的食品天然防腐劑提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

原蜂膠購自錦州某養(yǎng)蜂廠，對其進行研磨粉碎備用。

細菌菌種：金黃色葡萄球菌(S t a p h y l o c o c c u s aureus)、大腸桿菌(Escherichia coli)、沙門氏菌(Salmonella sp.)、蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus) 渤海大學食品安全教研室。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基按照文獻[9]配制。

1.2 儀器與設備

數(shù)顯恒溫水浴鍋 蘇州威爾實驗用品有限公司；真空抽濾裝置 北京華旦儀器科技發(fā)展有限公司；EYELA旋轉蒸發(fā)儀 日本東京理化器株式會社；LDZX-405AI立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；LRH-150-Ⅱ型生化培養(yǎng)箱 廣東省醫(yī)療器械廠；SW-CJ-1F超凈工作臺 上海陽光實驗儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蜂膠提取物及其樣品溶液的制備

稱取蜂膠細末，以四因素三水平正交試驗確定的最佳提取工藝條件為基礎進行提取，即以1:20的質量比例加入80%的乙醇，70℃水浴回流提取4h，過濾取濾液于旋轉蒸發(fā)儀上濃縮，冷凍干燥成粉。

1.3.2 菌種活化及菌懸液的制備

將所有供測試的菌種接入相應的試管斜面培養(yǎng)，每種接多支重復。細菌置37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。將上述活化好的各種菌分別挑取一環(huán)制成初試菌懸液，取適量初試菌懸液用生理鹽水將其稀釋成含菌量為1.0× 108CFU/mL 的菌懸液備用。

1.3.3 蜂膠提取液抑菌性實驗[10]

用打孔器制成直徑為6mm的滅菌圓形濾紙片。將濾紙高壓滅菌后浸入質量濃度為25g/100mL蜂膠提取液中20min，烘干備用。分別加入0.2mL供試菌的菌懸液在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基表面，用無菌L棒涂布均勻，15min后用無菌鑷子夾取蜂膠濾紙片貼于涂菌平板上。然后將平板置于37℃培養(yǎng)24h，按時取出，測定抑菌圈直徑，取其平均值為測定結果。以上操作均在超凈工作臺上完成。

1.4 蜂膠提取物穩(wěn)定性的研究[11-15]

選取提取物抑菌性能最顯著的細菌進行抑菌穩(wěn)定性的實驗研究。

1.4.1 熱穩(wěn)定性的研究

將蜂膠提取物分別在80、100、121℃處理0.5h和1h，用乙醇配制成質量濃度為25g/100mL的溶液，測定其抑菌活性。

1.4.2 酸堿穩(wěn)定性的研究

用不同pH值的乙醇溶液浸泡蜂膠提取物，其中提取物的質量濃度為25/100mL，12h后測定其抑菌活性。

1.4.3 紫外線穩(wěn)定性的研究

將粗提物分別在紫外燈(功率為20W)下處理10、30、60min，用乙醇配成質量濃度為25g/100mL的溶液，測定其抑菌活性。

1.4.4 金屬離子穩(wěn)定性的研究

用1mol/L的不同金屬離子(Na+、K+、Ca2+、Fe2+、Fe3+)溶液浸泡蜂膠提取物，其中提取物的質量濃度為25g/100mL，12h后測定其抑菌活性。

以上實驗均重復3 次，取其平均值為最終測定實驗結果。

2 結果與分析

2.1 蜂膠提取物抑菌性的確定

表1 蜂膠提取物對常見細菌的抑菌作用Table 1 Inhibitory effect of ethanol extract from propolis on common bacteria strains

由表1可知，蜂膠提取物對所選細菌的抑菌效果均較好，特別是對蠟樣芽孢桿菌的抑菌能力最為明顯。

2.2 蜂膠提取物穩(wěn)定性的研究

以表1的實驗結果為基礎，以蠟樣芽孢桿菌為指示菌進行蜂膠提取物抑菌穩(wěn)定性的系列研究。

2.2.1 熱穩(wěn)定性的研究

表2 溫度對提取物抑菌活性的影響Table 2 Effect of temperature on antimicrobial activity of ethanol extract from propolis

由表2可以看出，經80℃和100℃熱處理后提取物的抑菌性能略有下降，但仍具較強的抑菌活性。然而經121℃處理后，其抑菌性能出現(xiàn)了明顯的下降，下降幅度達50%。這表明提取物的抑菌活性對熱處理的溫度較為敏感，特別是121℃對其的影響已非常明顯，但處理時間對其性能的影響較小。

2.2.2 酸堿穩(wěn)定性的研究

表3 pH值對提取物抑菌活性的影響Table 3 Effect of pH on antimicrobial activity of ethanol extract from propolis

由表3可見，在pH值小于7 時，隨著pH值的增大，抑菌性逐漸增強；在pH值為7時，抑菌性能達到最大；但當pH值大于7時，其抑菌性隨pH 值的增加反而降低。因此，提取物的最適抑菌pH值為7。提取物經酸、中性及弱堿液處理處理后仍具有較強的抑菌活性，由此可見提取物中的抑菌成分耐酸但不耐堿，特別是強堿。原因可能是堿處理可能會使某些抑菌成分與溶液中的堿發(fā)生反應，從而使該物質的抑菌性減小。

2.2.3 紫外線穩(wěn)定性的研究

表4結果表明，隨紫外線處理時間的延長，提取物的抑菌活性基本保持不變，由此可見，該提取物對紫外線具有較高的穩(wěn)定性。

表4 紫外線對提取物抑菌活性的影響Table 4 Effect of ultraviolet on antimicrobial activity of ethanol extract from propolis

2.2.4 金屬離子穩(wěn)定性的研究

表5 金屬離子對提取物抑菌活性的影響Table 5 Effect of metal ions on antimicrobial activity of ethanol extract from propolis

由表5可以看出，經N a+、K+處理后，提取物的抑菌性能保持一致，但與未處理組相比，抑菌活性略有下降。而經鈣、鐵離子處理后其抑菌活性稍提高，其原因可能是金屬離子本身對菌體的生長存在抑制作用。

研究表明，蜂膠提取物中抑菌成分對熱與紫外線有良好的耐受力，對提取、分離、貯存及實際應用均具有十分重要的意義；提取物經酸、堿處理仍具有較好的活性，其中堿較酸對其活性的影響更大，其原因可能與提取物中抑菌物質的結構有關，準確的機理有待進一步研究。

由于本實驗采用的濾紙片法，采用一定酸堿度及離子濃度，無法確定溶劑中的真實酸堿度及離子濃度，因此可能在一定程度上存在缺陷，如用MIC或稀釋法進行研究其結果會更準確。

3 結 論

蜂膠提取物對不同的菌種均具有一定的抑菌效果，其中對革蘭氏陽性菌的抑菌能力大于革蘭氏陰性菌，特別是對蠟樣芽孢桿菌的抑菌性能最為顯著。

蜂膠提取物對熱處理、p H值、紫外線、金屬離子均具有較好的穩(wěn)定性，只是經121℃、pH10處理后其抑菌活性明顯下降。

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Antimicrobial Activity and Stability of Ethanol Extract from Propolis

MENG Liang-yu，LAN Tao-fang，LU Jia-kun，ZHANG Yi-fan，CHU Ying-ying
(Liaoning Provincial Key Laboratory of Food Quality Safety and Functional Food, College of Biology and Food Science, Bohai University, Jinzhou 121013, China)

The ethanol extract from propolis obtained by hot reflux extraction was assayed for its antimicrobial activity, and its stability was also studied with Bacillus cereus as the indicator strain. The results showed that the extract had very strong antimicrobial activity and was very stable to temperature, pH value, ultraviolet and metal ions. After thermal treatment at 121℃ or alkaline treatment at pH 10, the antimicrobial activity of the extract showed a notable descent.

propolis；antimicrobial activity；stability

TQ929.2

A

1002-6630(2010)21-0098-03

2010-08-03

渤大博士啟動科研基金項目(BSQD2010-006)；渤海大學大學生創(chuàng)新實驗項目(BDCX-019；BDCX-SP008)

孟良玉(1976—)，男，講師，博士，研究方向為功能食品與天然產物。E-mail：mengliangyu227@163.com