大鼠局灶性腦缺血再灌注模型的復(fù)制及評價

徐秋英,劉亞敏*,沈強(qiáng),曾征倫,夏鑫華

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,廣東廣州510405;2.廣州醫(yī)學(xué)院,廣東廣州510182)

腦血管疾病是危害人類生命和健康的常見病和多發(fā)病,其中缺血性腦卒中(AIS)占有相當(dāng)大的比例(75%～85%)[1]。大腦中動脈及其分支的梗死(簡稱MCAO)是人類腦梗死常見的發(fā)病形式之一[2]。為了解缺血性腦卒中的演變過程和藥物療效觀察,腦缺血動物模型已成為研究腦血管病損傷機(jī)理和防治措施不可缺少的工具,因而制作最接近人類缺血性腦卒中的理想動物模型一直是人們普遍關(guān)注的課題。近年來多數(shù)學(xué)者傾向于選用大鼠復(fù)制腦缺血模型,為了能夠最大限度地保證建立生理指標(biāo)控制嚴(yán)格、重復(fù)性好的整體動物模型。國際腦血管病委員會對局灶性腦缺血模型的手術(shù)和設(shè)計均提出明確要求。近20年來發(fā)展創(chuàng)立了許多新方法,運(yùn)用最廣泛的是線栓法。我們在完成課題研究過程中,選用改良的線栓法進(jìn)行了SD大鼠局灶性腦缺血/再灌注模型(以下簡稱為MCAO模型)的復(fù)制,逐漸摸索出一套操作簡便、穩(wěn)定性好、成功率高的模型復(fù)制方法,現(xiàn)介紹如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組 SPF級SD大鼠,雌雄兼用,體重260～300 g,廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。合格證號:SCXY(粵)2003-0001。隨機(jī)分為兩組,a:改良前模型組20只,b:改良后模型組20只。清潔動物房飼養(yǎng),恒溫恒濕[溫度(24±2)℃,濕度60%左右], SPF級大鼠飼料喂養(yǎng),自由進(jìn)水(消毒蒸餾水)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 水合氯醛(上海五聯(lián)化工廠),分析純,用生理鹽水配成10%濃度;多聚賴氨酸(Poly-LLysine,武漢博士德生物有限公司提供),使用前將原液濃度用蒸餾水稀釋至0.1%;肝素(山東齊魯制藥有限公司),使用前配成100 U/mL濃度。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 雙極射頻電凝器:SDQ-30,上海手術(shù)器械廠;數(shù)碼相機(jī):V3,日本SONY公司產(chǎn);電熱恒溫水浴箱:ZD-420,杭州藍(lán)天儀器;投射式電鏡:JEM-1200EX型,日本產(chǎn);超薄切片機(jī):AO,奧地利產(chǎn);大鼠腦墊:美國ZivicMiller公司生產(chǎn);動脈夾:寧波醫(yī)用縫針廠;絲線:0號手術(shù)縫合線;進(jìn)口尼龍線:直徑0.26 mm,長4 cm,在前段2 cm用黑色油性筆標(biāo)記,使用細(xì)砂紙打磨使頭端光滑、鈍圓、前段 2 cm浸入0.1%Poly-L-Lysine,5 min自然晾干,臨用前在頭端醮取肝素。無齒眼科鑷、手術(shù)剪、止血鉗、線剪、1 mL注射器等均為國產(chǎn)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 模型制備方法 參照Longa等[3]的線栓法復(fù)制大鼠MCAO模型。術(shù)前禁食12 h,自由飲水。手術(shù)前按0.35 mL/100 g為大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉,保留自主呼吸,仰臥位固定,術(shù)中體溫由肛溫計監(jiān)測,并用白熾燈加熱維持肛溫在36.5～37℃。取大鼠腹側(cè)頸部正中作為手術(shù)切口,沿胸鎖乳突機(jī)內(nèi)緣肌肉、筋膜,分離右側(cè)頸總動脈、頸外動脈、頸內(nèi)動脈和翼腭動脈,分離過程中電凝血管小分支及交通支以防出血。結(jié)扎右側(cè)翼腭動脈,在距右頸總動脈分叉約1 cm處結(jié)扎右頸外動脈,于遠(yuǎn)心端用電凝筆將其灼斷。動脈夾夾閉右頸總動脈、頸內(nèi)動脈,在右頸外動脈距結(jié)扎處近心端約0.5 cm處用4號皮內(nèi)注射針頭小心刺一小孔,牽拉右頸外動脈殘端,使其與右頸內(nèi)動脈成一直線,將尼龍線栓經(jīng)小孔緩慢向頸內(nèi)動脈入顱方向推進(jìn)并松開右頸內(nèi)動脈處動脈夾。以頸總動脈分叉處為標(biāo)記,推進(jìn)18～20 mm感到輕微阻力時,即已阻斷大腦中動脈血流。阻斷2 h后,撥出尼龍線,扎緊動脈殘端,縫合皮下組織和皮膚,完成缺血再灌注損傷模型。假手術(shù)組除不插線外,全過程同模型組。分別于缺血3,24,48 h對大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評分。

2.2 模型評價方法

2.2.1 行為學(xué)變化及神經(jīng)功能缺損評分 大鼠腦缺血2h麻醉清醒后,表現(xiàn)為不同程度的局灶性神經(jīng)功能障礙。如聳毛,左上肢屈曲內(nèi)收,提尾時左前肢內(nèi)收,向前爬行時向左側(cè)轉(zhuǎn)圈(追尾征)或向左側(cè)傾倒,側(cè)推抵抗力下降,蜷臥少動等;再灌注4～6 h后局灶性神經(jīng)功能障礙癥狀如左上肢屈曲內(nèi)收,及提尾向前爬行時向左側(cè)轉(zhuǎn)圈或向左側(cè)傾倒等基本消失,雙側(cè)抗側(cè)推抵抗力基本相同,僅表現(xiàn)為聳毛,蜷臥少動。按TiboGerriets等的評分標(biāo)準(zhǔn)并作少量修改,主要通過觀察動物的行為變化進(jìn)行評分。0分:無神經(jīng)功能缺失;1分:不能完全伸直左前肢;2分:行走時斷續(xù)向左側(cè)轉(zhuǎn)圈;3分:向左側(cè)持續(xù)轉(zhuǎn)圈;4分:向左側(cè)傾倒;5分:不能自動行走和意識水平下降。

2.2.2 腦梗死體積測定(TTC染色) 大鼠腦缺血2 h再灌注24 h后,麻醉后斷頭處死,迅速取出大鼠大腦,生理鹽水沖洗殘血,將大腦置0℃生理鹽水中15 min,再取出置于大鼠腦墊中,從額極間隔2 mm連續(xù)做6個腦組織冠狀切片,迅速放入2%TTC溶液中(TTC水溶液是一種無色溶液,是呼吸鏈中吡啶-核苷結(jié)構(gòu)酶系統(tǒng)的質(zhì)子受體,是脂溶性光敏感的復(fù)合物,與正常組織中的脫氫酶反應(yīng)呈紅色,缺血組織內(nèi)脫氫酶活性下降,不能反應(yīng),故不會產(chǎn)生變化呈蒼白色)。TTC染色用于測定梗死灶大小具有快速、直觀地確定梗塞范圍的優(yōu)點(diǎn),且境界清楚。37℃水浴箱恒溫孵育30 min后置10%甲醛中固定24 h,數(shù)碼相機(jī)用微距按切片順序排列拍取照片,輸入電腦,用真彩病理圖像分析軟件(技易科技)測量梗死灶面積,玫瑰紅色區(qū)為正常腦組織,蒼白色區(qū)為梗死區(qū),各腦片梗死面積之和乘以厚度(2 mm)為總的梗死體積。以梗死灶體積占全腦體積的百分率進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2.3.3 組織形態(tài)觀察 再灌注24 h后開顱取腦肉眼觀察,顱底有否出血,正常組腦組織顏色形態(tài)均正常,無蒼白及腫脹。腦缺血2 h再灌注24 h后缺血側(cè)大腦組織腫脹明顯,顏色變淺,軟腦膜血管有出血。取腦組織皮質(zhì)作常規(guī)脫水,石蠟包埋切片,厚度為5 μ m, HE染色后,光鏡下觀察神經(jīng)細(xì)胞組織形態(tài)學(xué)變化。光鏡下觀察,正常組腦神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整,細(xì)胞核較大,核仁清楚,細(xì)胞及間質(zhì)無水腫;腦缺血2 h再灌注24 h組腦神經(jīng)細(xì)胞多數(shù)神經(jīng)細(xì)胞核固縮,核仁顯示不清,細(xì)胞外空隙明顯增寬,間質(zhì)疏松,顯示細(xì)胞周圍及間質(zhì)水腫。

2.2.4 模型納入和舍去標(biāo)準(zhǔn) 造模過程中,神經(jīng)功能評分必須達(dá)到2～4分者,方可納入研究。如出現(xiàn)以下情況,模型應(yīng)舍去:(1)栓線插入深度不足18 mm,且無明顯神經(jīng)功能缺損表現(xiàn)或癥狀很輕;(2)蛛網(wǎng)膜下腔出血、大腦中動脈起始部或其附近的willis環(huán)動脈有凝血塊的大鼠,因?yàn)檫@是出血性腦損傷或永久性腦缺血損傷,而非腦缺血再灌注損傷;(3)手術(shù)時出血較多,癥狀很重或術(shù)后意識不清。

3 結(jié)果

改良前后大鼠MCAO模型各種率的比較,見表1。

表1 改良前后大鼠MCAO模型各種率的比較 例(%)

從表1可以看出,改良前后制作的MCAO模型,改良前蛛網(wǎng)膜下腔出血發(fā)生率30%、動物早期死亡率35%、模型復(fù)制的成功率35%;而改良后蛛網(wǎng)膜下腔出血發(fā)生率下降至5%(χ2=4.33,P＜0.05),動物早期死亡率下降至10%(χ2=3.58,P＜0.10),模型復(fù)制的成功率則上升到85%(χ2=10.42,P＜0.01)。

4 討論

關(guān)于MCAO模型的復(fù)制近年來多數(shù)學(xué)者傾向于選用SD大鼠,原因是:(1)大鼠腦血管解剖特點(diǎn)比較接近人類[4];(2)有關(guān)大鼠生理、生化、形態(tài)及藥理等方面的實(shí)驗(yàn)資料比較豐富,有利于進(jìn)行研究和比較; (3)價格低廉,可進(jìn)行較大量重復(fù)實(shí)驗(yàn);(4)純種鼠屬近親交配,品種相對一致,腦血管解剖和生理機(jī)能變異較小,故實(shí)驗(yàn)中損傷部位恒定,實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好;(5)大腦體積小,有利于進(jìn)行固定染色及病理組織學(xué)觀察。國際腦血管病委員會對MCAO模型的手術(shù)設(shè)計也有明確的要求:(1)單支血管可被重復(fù)阻滯,該血管阻塞引起的改變可從血流變化等方面觀察到;(2)實(shí)驗(yàn)對腦實(shí)質(zhì)造成的病變應(yīng)與人的接近,血管阻塞后該血管能再通,以恢復(fù)60%對缺血區(qū)的再灌注;(3)盡量減少對腦的手術(shù)性損傷,避免顱內(nèi)組織暴露于大氣中,避免顱內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定性遭到破壞;(4)巴比妥鹽在血管阻塞期間避免使用,以利于神經(jīng)障礙的觀察。對復(fù)制腦缺血模型手術(shù)方法,近20年來發(fā)展創(chuàng)立了許多新方法,包括開顱電凝阻斷法、開顱結(jié)扎法、化學(xué)刺激誘導(dǎo)血栓性閉塞法、夾閉法、光化學(xué)誘導(dǎo)血栓形成阻斷法、線栓法、顱外動脈注入微栓子、內(nèi)皮素(ET)灌注誘導(dǎo)血管收縮法的栓塞法等,但運(yùn)用最廣泛的是線栓法。線栓法制成的局灶性腦缺血模型無須開顱,屬相對非侵入性方法,避免了開顱術(shù)所帶來的弊端,另外它可以輕易地實(shí)現(xiàn)缺血后再灌注,準(zhǔn)確地控制缺血/再灌注時間,適用于神經(jīng)元對缺血敏感性、耐受性以及再灌注損傷和治療時間窗的研究,故目前應(yīng)用最為廣泛。當(dāng)然,線栓法也存在一些缺點(diǎn),如:(1)需要一定的手術(shù)技巧,制作流程相對復(fù)雜;(2)穩(wěn)定性欠佳,不同實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用該方法制備的模型在成功率、梗死體積、蛛網(wǎng)膜下腔出血發(fā)生率、動物早期死亡率等方面不盡相同;(3)動物品系及體重要求嚴(yán)格;(4)插入的尼龍線可能干擾到下丘腦體溫調(diào)節(jié)中樞的血液循環(huán),造成缺血后體溫升高的并發(fā)癥,對缺血結(jié)果有影響; (5)線栓造模過程是非直視下的手術(shù),血流是否完全阻斷不能即刻得知。

本研究在總結(jié)前人經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,動物品系選用的是純種近親交配的SD大鼠,手術(shù)方法則選擇目前運(yùn)用最為廣泛的線栓法。通過改良法制作MCAO模型,使制備模型的成功率從開始30%提高到80%,手術(shù)時間也從開始的需兩人合作1 h才能完成到后來單人操作只需15 min便能完成。筆者經(jīng)驗(yàn),(1)首先要嚴(yán)格控制大鼠的體重及品系,以盡量保持腦缺血的恒定性;(2)線栓的處理是造模成敗的關(guān)鍵。這里作特別的介紹,開始參考教科書介紹的方法,選用直徑0.26 mm的單股尼龍線,將頭端加熱使其直徑增大至0.3～0.5 mm的圓球形,理論上頭端增大似乎可增加栓塞的成功率,但實(shí)際操作時尼龍線頭端受熱后變異性大,圓球形并不完全整齊和光滑,線栓插入時很容易卡在翼腭動脈或顱底,導(dǎo)致插管不成功,后取消線栓加熱直接插管,又出現(xiàn)新的問題,插管時尖銳的線栓頭容易刺破顱內(nèi)血管造成蛛網(wǎng)膜下腔出血,導(dǎo)致動物模型癥狀過重甚至昏迷,無法進(jìn)行神經(jīng)功能評分,動物基本上存活不到實(shí)驗(yàn)設(shè)計所需的再灌注時間已經(jīng)死亡。后來嘗試將線栓頭端用細(xì)砂紙打磨光滑,線栓在插入前前段涂以多聚賴氨酸(Poly-L-lysine)以增加缺血的穩(wěn)定性,插入線栓時頭端蘸取肝素預(yù)防線栓部位形成血栓。通過改進(jìn)線栓頭,插管成功率大大提高,大鼠缺血側(cè)大腦經(jīng)TTC染色證實(shí)制作的大鼠缺血模型是成功的,證明線栓頭端不加熱成圓球形也可以完全栓住目的動脈,而動物死亡率則大幅降低,最終確定選用此法;(3)嚴(yán)格掌握線栓插入的深度和力度:一般是以頸總動脈分叉處為標(biāo)記,推進(jìn)18～20 mm感到輕微阻力時,即已阻斷大腦中動脈血流。具體操作時要特別注意,線栓插入過淺,前端未到大腦中動脈分叉處,插入過深則阻塞的是大腦后動脈,均不能達(dá)到阻塞大腦中動脈的目的;操作力度過輕線栓插不進(jìn),過重則容易造成血管內(nèi)皮的損傷或刺破血管引起腦出血,導(dǎo)致造模失敗;(4)拔出線栓動作輕柔并固定好線栓:應(yīng)拔出線栓進(jìn)行再灌注時,左手持手術(shù)鑷固定線栓結(jié)扎部位,右手輕輕的將線栓拔出,動作一定要輕柔,防止拉斷血管而無法再灌注或大出血導(dǎo)致動物死亡;(5)白熾燈加熱維持肛溫:手術(shù)雖然保持在22～26℃的環(huán)境中進(jìn)行,但因水合氯醛麻醉后可致大鼠體溫下降,影響腦缺血的穩(wěn)定性,所以手術(shù)操作時仍在手術(shù)區(qū)域加用白熾燈加熱以維持大鼠的肛溫。通過不斷的摸索和改進(jìn),筆者使用的大鼠局灶性腦缺血再灌注動物改良模型應(yīng)用于局灶性腦缺血的研究,通過早期行為學(xué)、TTC染色及組織學(xué)觀察,獲得了較為滿意的效果,可為研究缺血性腦卒中的演變過程和藥物療效觀察提供保障,是研究腦梗塞較為理想的方法之一。

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