影響始基卵泡啟動募集的調(diào)控因素*

李 爽 馬靈芝 夏 天 夏 陽

始基卵泡是女性的基本生殖單位，也是卵細胞儲備的唯一形式。自胚胎16周至出生后6個月，卵巢內(nèi)單層梭形前顆粒細胞圍繞初級卵母細胞形成始基卵泡。隨著始基卵泡池的建立，始基卵泡就開始了啟動和凋亡的過程。始基卵泡的募集分為啟動募集和周期募集。啟動募集是指始基卵泡在卵巢內(nèi)因子以及未知的調(diào)控機制作用下脫離始基卵泡池向初級卵泡轉(zhuǎn)化，此階段不受促性腺激素影響。周期募集是指在每個月經(jīng)周期中，當內(nèi)分泌環(huán)境（主要指促性腺激素分泌情況）發(fā)生變化時，能夠?qū)@種變化發(fā)生應答的卵泡開始轉(zhuǎn)變?yōu)榇渭壜雅荨Ｊ蓟雅莸膯幽技^程分為兩個階段：第一階段為前顆粒細胞由扁平狀向立方狀轉(zhuǎn)變，并伴隨顆粒細胞的增生；第二階段為卵母細胞體積增大和顆粒細胞的繼續(xù)增殖。始基卵泡的募集過程直接影響了女性一生中能夠提供的卵子數(shù)量，在卵巢生物學上有很重要的意義。本文對目前研究較多的幾種影響始基卵泡啟動募集的因素進行綜述如下。

1 始基卵泡的啟動募集不受下丘腦-垂體-卵巢軸直接調(diào)節(jié)

始基卵泡的啟動募集與促卵泡生成素（follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH）和黃體生成激素（luteinizing hormone，LH）無關。到次級卵泡階段才出現(xiàn)FSH和LH受體，因此始基卵泡中沒有功能性的FSH和LH受體。垂體切除的大鼠、小鼠的始基卵泡同樣可被啟動募集，并發(fā)展為初級卵泡。Braw等[1]研究表明，在不添加FSH和血清的條件下，體外培養(yǎng)的鼠、兔、牛和羊的始基卵泡均可進入生長池。因此可以證明FSH和LH不參與始基卵泡的啟動募集，始基卵泡的啟動募集主要受卵巢局部調(diào)節(jié)因子的控制。

2 卵巢局部調(diào)節(jié)因子

2.1 始基卵泡生長促進因子 干細胞因子（stem cell factor,SCF）屬于白細胞介素-6家族成員，是最早發(fā)現(xiàn)的能夠促進始基卵泡募集的旁分泌因子。因SCF是酪氨酸激酶受體（c-Kit）的配體（ligand of c-Kit receptor,KL），因此 SCF 又稱 KL。KL及其受體在卵巢組織的表達存在物種差異性。山羊卵巢組織中各級卵泡的顆粒細胞內(nèi)均可檢測到KL mRNA和蛋白，卵母細胞內(nèi)則檢測到c－Kit mRNA和蛋白[2]。在人卵巢中，顆粒細胞、卵泡膜細胞、間質(zhì)細胞和卵巢上皮細胞均產(chǎn)生KL。c-Kit則主要表達于卵母細胞，同時在人的卵巢顆粒細胞和卵泡膜細胞上也檢測到了c-Kit的表達,表明除顆粒細胞與卵母細胞之間相互作用以外，KL還可能直接作用于顆粒細胞和卵泡膜細胞并調(diào)控其生長分化，從而間接調(diào)控卵母細胞的生長發(fā)育。但近年來的研究表明，不同物種間KL及其受體對卵泡發(fā)育的作用不盡相同。Hutt等[3]對家兔的研究表明，雖然在卵泡早期發(fā)育過程中KL及其受體具有促進家兔卵母細胞生長的作用，但卻無啟動始基卵泡發(fā)育的作用。Moniruzzaman等[4]研究證實KL與豬始基卵泡的啟動和發(fā)育無明顯相關性,而僅與維持卵母細胞存活、發(fā)揮抗卵母細胞凋亡有關。Carlsson等[5]也用不同濃度的KL與卵巢組織體外共同培養(yǎng),結(jié)果外源性KL不能增加初級卵泡數(shù)，也不能提高體外培養(yǎng)中各級生長卵泡數(shù)；阻斷KL作用后，體外培養(yǎng)卵巢組織中各級卵泡凋亡率增加，因此外源性KL可能僅與卵泡早期發(fā)育中的抗凋亡有關。

堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）是成纖維細胞生長因子超家族成員之一。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)5種形式的bFGF，其中分泌到胞外的主要是分子質(zhì)量為18 ku的bFGF，也是目前研究最多的bFGF[6]。在小鼠卵巢中，bFGF在所有階段的卵母細胞中均有表達。在人類卵巢中,bFGF及其受體FGFR-2、FGFR-3、FGFR-4在各階段卵泡卵母細胞均有表達，在青春期后的女性卵巢顆粒細胞也有表達。bFGF是一種強有力的有絲分裂原，是誘導始基卵泡募集的重要細胞因子，它能夠調(diào)節(jié)顆粒細胞的有絲分裂、分化、凋亡及甾體激素的合成，刺激卵泡膜細胞和間質(zhì)細胞生長，通過作用于周圍的顆粒細胞促進始基卵泡向初級卵泡轉(zhuǎn)化。此外，bFGF還以旁分泌途徑影響卵泡內(nèi)膜細胞血管的發(fā)生。

白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor,LIF）是白細胞介素-6家族成員，其可調(diào)節(jié)多種組織和細胞的生長及凋亡。Nilsson等[7]對大鼠卵巢內(nèi)LIF的研究表明，在始基卵泡和初級卵泡階段，LIF在顆粒細胞及周圍體細胞中的表達高于卵母細胞；而在次級卵泡中，LIF主要在卵母細胞中表達，而在顆粒細胞及周圍的體細胞中的表達很少。LIF促進始基卵泡募集，抗LIF抗體可降低自發(fā)的始基卵泡的轉(zhuǎn)化率。該實驗還發(fā)現(xiàn)LIF能上調(diào)顆粒細胞KL的表達，而對始基卵泡顆粒細胞的生長沒有直接影響，以此推測LIF可能是通過促進顆粒細胞產(chǎn)生KL來促進始基卵泡向初級卵泡的過渡。

骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenic proteins，BMP）屬于轉(zhuǎn)化生長因子-β超家族成員。第一個顯示與始基卵泡發(fā)育相關的BMP是BMP－15。BMP－15與其他家族成員不同，缺乏形成共價二聚體的半胱氨酸殘基，由卵母細胞分泌[8-9]。在人類始基卵泡、初級卵泡和次級卵泡，甚至成熟卵泡中均有表達[10]。BMP-15作為顆粒細胞有絲分裂的刺激因子，主要通過促進顆粒細胞減數(shù)分裂、刺激KL的表達來影響早期卵泡的發(fā)育。在以后的發(fā)育中BMP-15也可以通過自分泌或旁分泌的方式影響卵泡的閉鎖以及優(yōu)勢卵泡的選擇[11]。BMP-4是由間質(zhì)細胞分泌的維持始基卵泡存活的必需因子，其作用于鄰近的顆粒細胞，可以顯著增加始基卵泡向初級卵泡的轉(zhuǎn)化率。BMP-4不但可以提高FSH誘導的顆粒細胞分泌雌二醇，抑制孕激素的分泌，而且還可以與激活素、促性腺激素釋放激素相互作用從而調(diào)節(jié)促性腺激素的分泌[12]。動物實驗顯示向培養(yǎng)液中加入BMP-4中和抗體后,卵巢細胞減少的同時凋亡細胞相應增加，卵巢體積縮小，正常形態(tài)喪失；人體試驗也得出相似結(jié)論[13]。

生長分化因子－9（growth differentiation factor－9，GDF－9）也是轉(zhuǎn)化生長因子－β超家族成員。其在自始基卵泡起的各階段卵母細胞中均有表達。Wang等[14]發(fā)現(xiàn)GDF-9促進始基卵泡形成，用GDF-9的小干擾RNA抑制GDF-9活性可以抑制始基卵泡的形成。Juengel等[15]在對牛的研究中發(fā)現(xiàn)，GDF-9是調(diào)節(jié)卵泡正常發(fā)育和排卵的關鍵因素。最新的研究表明，卵母細胞通過GDF-9調(diào)節(jié)卵丘膽固醇的合成[16]。Gilchrist等[17]進一步研究表明，當卵母細胞缺乏膽固醇時，卵母細胞源性的GDF-9通過促進卵丘合成膽固醇來彌補卵母細胞中膽固醇產(chǎn)生的不足，證明卵母細胞和卵丘間具有雙向調(diào)節(jié)作用。GDF-9對卵泡膜細胞功能方面也有重要的調(diào)節(jié)作用，并且小的卵泡膜細胞比大的卵泡膜細胞對GDF-9更加敏感[18]。Shi等[19]研究表明GDF-9可調(diào)控激活信號傳導通路的關鍵部分，通過增強細胞對激活素A的反應性，從而增強激活素A誘導的抑制素B在人類顆粒細胞的產(chǎn)生。

角化細胞生長因子（keratinocyte growth factor,KGF）是成纖維生長因子家族成員，由新募集的前體膜細胞產(chǎn)生，作用于臨近的顆粒細胞，是目前發(fā)現(xiàn)的第一個發(fā)育中的前體膜細胞標志物。發(fā)育中始基卵泡的前體膜細胞能產(chǎn)生KGF，KGF又作用于鄰近顆粒細胞使其產(chǎn)生KL，KL有助于募集前體膜細胞，產(chǎn)生KGF的同時也增強了KL的表達，從而產(chǎn)生正反饋回路。

表皮生長因子（epidermal growth factor,EGF）是由153個氨基酸組成的單鏈多肽。在羊的始基卵泡和初級卵泡的卵母細胞和顆粒細胞均表達EGF mRNA和蛋白[20]。在人類的卵巢中，EGF在始基卵泡和初級卵泡的卵母細胞中表達量較高，在初級卵泡的顆粒細胞以及各級卵泡的卵泡膜細胞中表達量也較高。EGF在人類始基卵泡募集和卵泡的發(fā)育過程中起重要作用，其可促進靜息細胞表達增殖細胞核抗原（PCNA），導致細胞周期改變，促進細胞增殖，使卵泡進入生長相。同時EGF也能刺激始基卵泡類固醇激素的分泌。柳海珍等[21]以PCNA為指標，研究EGF和FSH對新生大鼠始基卵泡生長啟動的作用，結(jié)果顯示，EGF能促進始基卵泡前體顆粒細胞增殖分化，而FSH對始基卵泡生長啟動則不發(fā)揮作用。

胰島素樣生長因子（insulin-like growth factor,IGF）系統(tǒng)是一組多功能細胞增殖調(diào)控因子，由2類多肽生長因子（IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ）、2類IGF受體（IGFR-Ⅰ、IGFR-Ⅱ）和至少7種結(jié)合蛋白（IGFBPs）及IGFBP特異性蛋白分解酶構(gòu)成，因其化學結(jié)構(gòu)與胰島素原類似而得名。Louhio等[22]研究表明雄激素通過促進始基卵泡卵母細胞表達IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ、IGFR-Ⅰ和IGFR-Ⅱ參與始基卵泡的啟動過程。IGF-Ⅰ和IGFR-Ⅰ可介導雄激素促進早期卵泡發(fā)育。IGF-ⅡmRNA在卵母細胞任何發(fā)育階段上均高表達，在卵泡發(fā)育的起始階段，IGF-Ⅱ不僅與IGFR-Ⅱ，還可與IGFR-Ⅰ結(jié)合，通過兩種不同途徑傳遞信號，激活抗凋亡基因，促進始基卵泡的顆粒細胞和卵母細胞的發(fā)育。

2.2 始基卵泡生長抑制因子 抗苗勒激素（anti-Müllerian hormone,AMH）是轉(zhuǎn)化生長因子－β超家族成員，是目前發(fā)現(xiàn)的唯一抑制始基卵泡募集的生長因子。人類AMH最初表達于初級卵泡的顆粒細胞，在竇前卵泡及小竇狀卵泡中表達最強，隨著卵泡逐漸增大，AMH表達量也逐漸減少，當卵泡直徑＞8 mm時，AMH表達幾乎完全消失，僅在卵丘的顆粒細胞中有少量殘存。AMH可抑制體外培養(yǎng)的新生卵巢始基卵泡的募集。Durlinger等[23]通過添加AMH和不添加AMH體外培養(yǎng)新生小鼠卵巢的研究表明，2日齡新生小鼠的卵巢中含有始基卵泡和裸卵，但不含生長卵泡；而添加AMH實驗組經(jīng)體外培養(yǎng)2 d或4 d后發(fā)現(xiàn)生長卵泡數(shù)量較對照組減少40%～50%。實驗還發(fā)現(xiàn)，AMH基因缺失的小鼠出生25 d后卵巢內(nèi)生長卵泡數(shù)量較同窩小鼠明顯增多，至4月齡時卵巢內(nèi)生長卵泡數(shù)目是正常小鼠的3倍，并且始基卵泡數(shù)明顯減少，最終導致始基卵泡池過早耗竭。大量實驗表明，AMH可作為始基卵泡生長抑制因子，抑制始基卵泡的啟動募集。作為旁分泌因子，AMH的分泌不受促性腺激素的調(diào)控。體外受精的患者給予單一、大劑量的促性腺激素釋放激素激動劑后，盡管內(nèi)源性FSH及LH水平均升高，但AMH含量卻未受到影響。Wouter等[24]通過觀察44例正常月經(jīng)周期婦女整個月經(jīng)周期中血清AMH水平的變化發(fā)現(xiàn)，AMH水平在月經(jīng)周期的各個階段均無實質(zhì)性波動。Kevenaar等[25]研究發(fā)現(xiàn)，小鼠卵巢內(nèi)生長卵泡數(shù)目與始基卵泡數(shù)目呈明顯相關性，血清中AMH水平與生長卵泡及始基卵泡的數(shù)目呈強相關性。所以AMH不受促性腺素影響，也不受月經(jīng)周期的限制，又可相對地反映始基卵泡池的存量，因而AMH也可作為卵巢儲備的標志之一。

3 始基卵泡細胞之間的相互作用

始基卵泡的啟動募集不受促性腺激素的調(diào)節(jié)，因而其卵巢內(nèi)部的生長環(huán)境尤為重要。由卵母細胞、顆粒細胞和卵泡膜細胞構(gòu)成的卵巢微環(huán)境是卵泡發(fā)育的重要場所。嚴密的信號傳導結(jié)構(gòu)和交錯的信息調(diào)節(jié)網(wǎng)絡是卵泡啟動和發(fā)育的必備條件。在結(jié)構(gòu)方面，始基卵泡細胞之間為了相互傳遞信息的需要，在卵泡細胞之間、卵母細胞和顆粒細胞間、顆粒細胞之間、顆粒細胞和卵泡膜細胞間建立了廣泛的信號聯(lián)系，這些信號聯(lián)系參與調(diào)節(jié)始基卵泡的啟動募集過程。透明帶是卵母細胞和顆粒細胞間主要的物質(zhì)、能量及信息交換結(jié)構(gòu)。縫隙連接是卵丘顆粒細胞形成的突出物穿過透明帶與卵母細胞表面的突起形成的接觸。構(gòu)成縫隙連接的主要成分和標志物是連接蛋白。同樣參與卵泡早期生長啟動的重要因素還有細胞黏附分子E-鈣黏素、P-鈣黏素等。這些細胞之間的相互聯(lián)系在始基卵泡的啟動過程中都起了重要的作用。體外培養(yǎng)表明，將不成熟的卵母細胞與顆粒細胞分離培養(yǎng)時，二者均不能生長；共培養(yǎng)時，卵母細胞與顆粒細胞間自動形成縫隙連接，這與它們在卵泡中的空間結(jié)構(gòu)相似。在信息調(diào)解網(wǎng)絡方面，卵泡細胞間存在復雜的信號傳導系統(tǒng)。始基卵泡細胞之間通過細胞因子相互作用調(diào)節(jié)始基卵泡的募集。卵母細胞產(chǎn)生的細胞因子bFGF作用于顆粒細胞和卵泡膜細胞上的bFGF受體，使顆粒細胞和卵泡膜細胞增生；同樣的顆粒細胞分泌的KL也作用于卵母細胞和卵泡膜細胞，調(diào)節(jié)始基卵泡的募集。Eppig等[26]將次級卵泡的卵母細胞取出植入到始基卵泡內(nèi)，始基卵泡迅速生長，顆粒細胞分化加快，并且卵母細胞發(fā)育正常，能夠受精形成胚胎，說明卵泡細胞之間具有雙向調(diào)節(jié)作用。不僅卵泡細胞之間具有信息調(diào)節(jié)作用，各種細胞因子之間也形成各種相互交錯的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡。研究表明BMP-15與KL之間存在負反饋調(diào)節(jié)系統(tǒng)，Otsuka等[27]在體外培養(yǎng)小鼠卵泡細胞發(fā)現(xiàn)，卵母細胞產(chǎn)生BMP-15促進顆粒細胞表達KL，而過量的KL反過來又抑制卵母細胞表達BMP-15，兩者之間形成雙向的調(diào)節(jié)環(huán)路，共同調(diào)控始基卵泡的啟動募集。

卵泡的啟動受多種自分泌和旁分泌等因素的影響，是一個極其復雜的過程。探討卵泡發(fā)育的本質(zhì)和卵巢局部調(diào)節(jié)因子對卵巢微環(huán)境的作用，對揭示始基卵泡的啟動機制和卵母細胞的體外成熟大有裨益。

[1] Braw TR,Yossefi S.Studies in vivo and in vitro on the initiation of follicle growth in the bovine ovary[J].J Reprod Fertil,1997,109(1):165-171.

[2] Silva JR,van den Hurk R,van Tol HT,et al.The Kit ligand/c-Kit receptor system in goat ovaries:gene expression and protein localization[J].Zygote,2006,14(4):317-328.

[3] Hutt KJ,McLaughlin EA,Holland MK.KIT/KIT ligand in mammalian oogenesis and folliculogenesis:roles in rabbit and murine ovarian follicle activation and oocyte growth[J].Biol Reproduction,2006,75(3):421-433.

[4] Moniruzzaman M,Miyano T.KIT-KIT ligand in the growth of porcine oocytes in primordial follicles[J].Reprod,2007,53(6):1273-1281.

[5] Carlsson IB,Laitinen MP,Scott JE,et al.Kit ligand and c-Kit are expressed during early human ovarian follicular development and their interaction is required for the survival of follicles in long-term culture[J].Reprod,2006,131(4):641-649.

[6] Malkowski A,Sobolewski K,Jaworski S,et al.FGF binding by extracellular matrix components of Wharton’s jelly[J].Acta Biochim Pol,2007,54(2):357.

[7] Nilsson EE,Kezele P,Skinner MK.Leukemia inhibitory factor(LIF)promotes the primordial to primary follicle transition in rat ovaries[J].Mol Cell Endocrinol,2002,188(1-2):65-73.

[8] Gueripel X,Brun V,Gougeon A.Oocyte bone morphogenetic protein 15,but not growth differentiation factor 9,is increased during gonadotropin-induced follicular development in the immature mouse and is associated with cumulus oophorus expansion[J].Biol Reprod,2006,75(6):836-843.

[9] Martinez-Royo A,Jurado JJ,Smulders JP,et al.A deletion in the bone morphogenetic protein 15 gene causes sterility and increased prolificacy in Rasa Aragonesa sheep[J].Anim Genet,2008,39(3):294-297.

[10]Mery L,Lefevre A,Benchaib M,et al.Follicular growth in vitro:detection of growth differentiation factor 9(GDF-9)and bone morphogenetic protein 15(BMP-15)during in vitro culture of ovine cortical slices[J].Mol Reprod,2007,74(6):767-774.

[11]Liu L,Rajareddy S,Reddy P,et al.Infertility caused by retardation of follicular development in mice with oocyte-specific expression of Foxo3a[J].Development,2007,134(1):199-209.

[12]Nicol L,Faure MO,McNeilly JR,et al.Bone morphogenetic protein-4 interacts with activin and GnRH to modulate gonadotrophin secretion in LbetaT2 gonadotrophs[J].Endocrinol,2008,196(3):497-507．

[13]Tanwar PS,O′shea T,McFarlane JR.In vivo evidence of role of bone morphogenetic protein-4 in the mouse ovary[J].Anim Reprod Sci,2008,106(3/4):232-240．

[14]Wang C,Roy SK.Expression of growth differentiation factor-9 in the oocytes is essential for the development of primordial follicles in the hamster ovary[J].Endocrinology,2006,147(4):1725-1734.

[15]Juengel J,Hudson N,Berg M,et al.Effects of active immunization against growth differentiation factor 9(GDF9)and/or bone morphogenetic protein 15(BMP15)on ovarian function in cattle[J].Reproduction,2009,138(1):107-114.

[16]Su YQ,Sugiura K,Wigglesworth K,et al.Oocyte regulation of metabolic cooperativity between mouse cumulus cells and oocytes:BMP15 and GDF9 control cholesterol biosynthesis in cumulus cells[J].Development,2008,135(1):111-121.

[17]Gilchrist RB,Lane M,Thompson JG.Oocyte-secreted factors：regulators of cumulus cell function and oocyte quality[J].Hum Reprod Update,2008,14(2):159-177.

[18]Spicer LJ,Aad PY,Allenet DT,et al.Growth differentiation factor 9(GDF9)stimulates proliferation and inhibits steroidogenesis by bovine theca cells:influence of follicle size on responses to GDF9[J].Biol Reprod，2008,78(2):243-253.

[19]Shi FT,Cheung AP,Leung PC.Growth differentiation factor 9 enhances activin A-induced inhibin B production in human granulosa cells[J].Endocrinology,2009,150(8):3540-3546.

[20]Silva JR,van den Hurk R,Figueiredo JR.Expression of mRNA and protein localization of epidermal growth factor and its receptor in goat ovaries[J].Zygote,2006,14(2):107-117.

[21]柳海珍,劉以訓.EGF在新生大鼠原始卵泡生長啟動中的作用[J].中國科學(C輯),2000,30(3):322-329.

[22]Louhio H,Hovatta O,Sj觟berg J,et al.The effects of insulin,and insulin-like growth factors I and II on human ovarian follicles in long-term culture[J].Mol Hum Reprod,2000,6(8):694-698.

[23]Durlinger AL,Gruijters MJ,Kramer P,et al.Anti-Mullerian hormone inhibits initiation of primordial follicle grouth in the mouse ovary[J].Endocrinology,2002,143(3):1076-1084.

[24]Wouter JKH,Caspar WNL,Axel PNT,et al.Anti-Müllerian Hormone levels in the spontaneous menstrual cycle do not show substantial fluctuation[J].J Clin Endocrin Metab,2006,91(10):4057-4063.

[25]Kevenaar ME,Meerasahib MF,Kramer P,et al.Serum AMH levels reflect the size of the primordial follicle pool in mice[J].Endocrinol,2006,147(7):3228-3234.

[26]Eppig JJ,Wigglesworth K,Pendola FL.The mammalian oocyte orchestrates the rate of ovarian follicular development[J].Proc Natl A-cad Sci USA,2002,99(5):2890-2894.

[27]Otsuka F,Shimasaki S.A negative feedback system between oocyte bone morphogenetic protein 15 and granulosa cell kit ligand:its role in regulating granulosa cell mitosis[J].Proc Natl Acad Sci USA,2002,99(12):8060-8065.