食管鱗狀細(xì)胞癌組織中表皮調(diào)節(jié)素、雙調(diào)蛋白及表皮生長因子受體mRNA的表達(dá)

劉欣欣,趙江沙,印宏坤,謝 東,李文杰

鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)教研室鄭州 450001

#通訊作者,男,1958年生,碩士,教授,研究方向:營養(yǎng)與疾病

食管癌的 2種病理類型是食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)和食管腺癌。據(jù)報(bào)道[1],中國是世界上食管癌發(fā)病率和病死率最高的國家。目前,研究[2]證實(shí)有些基因在食管癌組織中過度表達(dá),如表皮生長因子受體(epidermal grow th factor receptor,EGFR)。其配體表皮調(diào)節(jié)素(epiregulin,EREG)和雙調(diào)蛋白(amphiregulin, AREG)在某些腫瘤如胰腺癌、骨肉瘤和結(jié)腸癌等組織中過度表達(dá)[3-8]。作者探討了 ESCC組織中EREG、AREG和EGFRmRNA的表達(dá)情況,并分析其與臨床病理特征的關(guān)系,為探討EGFR家族受體與配體在食管癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 收集河南省林縣腫瘤醫(yī)院2007年臨床病理資料完整的手術(shù)切除及食管鏡活檢標(biāo)本共47例,均為 ESCC,取材部位為癌旁正常食管黏膜和癌組織,其中女 34例,男 13例,年齡 45～78歲,≥60歲 24例,＜60歲 23例。腫瘤位于黏膜層 16例,肌層 27例,纖維膜層 4例;腫瘤分化程度為高分化7例,中分化 24例,低分化或無分化 16例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 28例,無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 19例;臨床分型Ⅰ型 5例,Ⅱ型 21例,Ⅲ型 21例。

1.2 主要試劑 Trizol試劑(美國英杰生命技術(shù)有限公司),三氯甲烷(上海試劑一廠),異丙醇和乙醇(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司),反轉(zhuǎn)錄cDNA試劑盒(普洛麥格生物技術(shù)有限公司),實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(real time RT-PCR)試劑盒(天根生化技術(shù)有限公司)。

1.3 ESCC組織中EREG、AREG和EGFR m RNA的檢測

1.3.1 組織中總RNA的提取 從冰箱取出組織,切下綠豆塊大小磨碎,加入1 mL Trizol,混合后吸入1.5mL EP管中。在低速離心機(jī)中離心15 min,吸取上清液置于另一EP管。加三氯甲烷0.2mL,劇烈晃動(dòng),充分混勻,室溫下放置2～3min。低速離心15min,吸取上清液于另一EP管中。加入等體積異丙醇混勻,室溫放置10min,低速離心10m in。倒掉異丙醇,用1m L體積分?jǐn)?shù)75%乙醇洗滌沉淀RNA,低速離心5 min。倒掉乙醇,干燥RNA,加入焦碳酸二乙酯處理水溶解 RNA。按體積比 1∶70稀釋RNA,然后在可見光分光度儀下測定RNA濃度。

1.3.2 cDNA反轉(zhuǎn)錄 在無RNA酶的EP管中加入9μL RNA和1μL引物,先放冰上,然后70℃水浴,放置5min。反應(yīng)體系:逆轉(zhuǎn)錄酶5×緩沖液 5 μL,三磷酸堿基脫氧核苷酸 5μL,RNA酶抑制物0.625μL,逆轉(zhuǎn)錄酶 1μL,焦碳酸二乙酯處理水3.375μL,共 15μL。70℃水浴后,每管中加入上述反應(yīng)體系15μL,共20μL,室溫放置10min,然后37℃水浴 1 h。

1.3.3 引物設(shè)計(jì) 使用軟件Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物。EREG(132 bp):上游引物5'-TGGGTTTC CATCTTCTA-3',下游引物5'-GTTATTGACACTTG AGCC-3';AREG(156 bp):上游引物5'-GGAGCC GACTATGACTA-3',下游引物5'-TCACTTTCC GTCTTGTT-3';EGFR(143 bp):上游引物5'-GGGT GAGCCAAGGGAGT-3',下游引物5'-GGGCCGTC AATGTAGTG-3';內(nèi)參照為RP2(151 bp):上游引物5'-GCAGGACGTAATAGAGG-3',下游引物5'-CGG ACACGACCATAGA-3'。以上引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.3.4 real time RT-PCR方法 擴(kuò)增體系為15μL:模板5μL,雙蒸水4.735μL,Taq反應(yīng)緩沖液1.5 μL,三磷酸堿基脫氧核苷酸1.125μL,氯化鎂0.9 μL,Eva Green試劑0.75μL,熒光染料0.09μL,上游引物3μmol,下游引物3μmol,Taq DNA聚合酶 0.2μL。每個(gè)模板 2個(gè)平行管,1個(gè)陰性對照。反應(yīng)條件為:首先95℃2.5min 1個(gè)循環(huán);然后解鏈95℃15 s,退火56℃16 s,延伸 72℃20 s,45個(gè)循環(huán);最后72℃5min 1個(gè)循環(huán)。共200個(gè)循環(huán)。采用內(nèi)參照RP2校正目的基因的表達(dá)水平。以ESCC組織目的基因表達(dá)水平減去正常食管黏膜組織表達(dá)水平,結(jié)果為正判為高表達(dá),結(jié)果為負(fù)判為低表達(dá)[9]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 12.0對2種組織中EREG、AREG和EGFR mRNA表達(dá)水平行配對t檢驗(yàn),對ESCC組織中EREG、AREG和EGFR mRNA表達(dá)水平行Spearman等級相關(guān)分析,對ESCC組織中EREG、AREG和EGFRmRNA表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系行關(guān)聯(lián)性分析,檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 正常食管黏膜和ESCC組織中EREG、AREG和EGFR mRNA表達(dá)水平 相對于正常食管黏膜組織表達(dá)水平,47例ESCC組織中EREG低表達(dá)31例(66%),AREG低表達(dá)34例(72%),EGFR高表達(dá)36例(77%)。正常食管黏膜和ESCC組織中EREG、AREG和EGFR mRNA表達(dá)水平的比較見表1。ESCC組織中EREG、AREG和EGFRmRNA表達(dá)水平的相關(guān)性分析結(jié)果見表 2。

表1 正常食管黏膜和ESCC組織中EREG、AREG和EGFR mRNA相對表達(dá)水平的比較

表2 ESCC組織中EREG、AREG和EGFR mRNA表達(dá)水平的相關(guān)性分析

2.2 ESCC組織中EREG、AREG和EGFR m RNA表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系 ESCC組織中EREG mRNA表達(dá)水平與臨床分型有關(guān),AREG mRNA表達(dá)水平與性別有關(guān),見表3。

表3 ESCC組織中EREG、AREG和EGFR mRNA表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果 例

3 討論

EGF家族有4個(gè)受體:EGFR、HER2/ERBB2、HER3/ERBB3和HER4/ERBB4。ERBB結(jié)合的配體一般分為3類,第1類是EGF、AREG和TGF-α,它們只與EGFR特異性結(jié)合;第2類是BTC、HBEGF和EREG,它們具有雙重特異性,可以與EGFR和ERBB4結(jié)合;第3類是NRG、NRG1和NRG2,與ERBB3和ERBB4結(jié)合,以及NRG3和NRG4,只與ERBB4結(jié)合。ERBB2沒有結(jié)合的配體,它和其他受體結(jié)合共同起作用。ERBB受體不僅在正常細(xì)胞、組織生理活動(dòng)中起重要作用,而且在很多腫瘤的發(fā)生發(fā)展中也發(fā)揮一定作用。EGFR和ERBB2水平異常的腫瘤一般惡性程度較高,并且預(yù)后較差[10]。

有研究[2]報(bào)道在頭頸鱗狀細(xì)胞癌、非小細(xì)胞肺癌、卵巢癌、乳癌、結(jié)腸癌、膀胱癌、胃癌、甲狀腺癌及子宮頸癌等組織中EGFR的mRNA和蛋白都過度表達(dá),該研究結(jié)果與此一致。由此可見,EGFR在食管癌的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用。

EREG結(jié)合受體范圍比較寬泛,可以直接激活EGFR或ERBB4的同源二聚體,也可以激活異源二聚體復(fù)合物。有研究[11]檢測到在一些人腫瘤細(xì)胞中,包括膀胱癌、肺癌、腎癌和結(jié)腸癌,EREGmRNA過度表達(dá)。然而,在該研究中EREGmRNA在ESCC組織中低表達(dá),與Di Fiore等[12]結(jié)果一致。

體外研究[13]證明,EGFR過表達(dá)不足以引起受體激活,而需要配體的結(jié)合。與此同時(shí),TGF-α與EGFR在一些早期腫瘤組織中結(jié)合表達(dá)[14]。ERBB家族的配體可分為2類,與高親和力配體(如EGF、HB-EGF)不同,低親和力配體(如EREG、AREG和EPGN)通過避免信號脫敏的生理機(jī)制來獲得高效能[15]。因此,通過分析該研究結(jié)果可以推測:首先,EGFR可能更容易與那些高親和力配體(如EGF、HB-EGF)結(jié)合,激活下游酪氨酸激酶起作用,而與低親和力配體結(jié)合不十分緊密,所以這些低親和力配體作用不明顯;另外,低親和力配體可能通過其他途徑結(jié)合并激活受體。有研究[9]表明,一些ERBB配體(如AREG、EREG、TGF-α和HB-EGF)在腫瘤組織中協(xié)同過度表達(dá)。該研究結(jié)果中,EREG和AREG在ESCC組織中表達(dá)水平比正常組織低,一方面,可能與選擇的腫瘤類型有關(guān),另一方面,可能存在其他調(diào)控機(jī)制。所以需對其作用機(jī)制進(jìn)行更深一步的研究。

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