不同持續(xù)時(shí)間有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化大鼠血管內(nèi)皮依賴性舒張功能的影響

周 亮 申偉華 唐 暉

（湖南科技大學(xué)體育學(xué)院，湖南湘潭411201）

動(dòng)脈粥樣硬化 （atherosclerosis，AS）是危害人類健康的一種常見老年疾病。研究表明，有氧運(yùn)動(dòng)是改善心血管健康，預(yù)防和輔助治療動(dòng)脈粥樣硬化的有效手段。已知運(yùn)動(dòng)改善心血管健康與促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的NO釋放、改善血管內(nèi)皮依賴性舒張功能有關(guān)，但是不明確何種強(qiáng)度和多長時(shí)間的運(yùn)動(dòng)為最適宜刺激。血管內(nèi)皮依賴性舒張功能主要受NO和ET兩種信號(hào)分子的調(diào)節(jié)，NO為內(nèi)皮細(xì)胞釋放的舒張血管物質(zhì)，而ET是已知的最為有效的收縮血管的物質(zhì)。內(nèi)皮細(xì)胞的NO釋放受一些因素的調(diào)節(jié)，其中NOS是NO合成的關(guān)鍵限速酶，L-Arg可以有效促進(jìn)NO釋放，但是L-Arg的競(jìng)爭(zhēng)抑制物ADMA卻抑制內(nèi)皮的NO釋放。關(guān)于不同運(yùn)動(dòng)持續(xù)時(shí)間對(duì)血管內(nèi)皮依賴性舒張功能的影響鮮見報(bào)道，本研究試圖探索不同運(yùn)動(dòng)時(shí)間對(duì)內(nèi)皮NO釋放量和一些調(diào)節(jié)內(nèi)皮NO釋放的因素的影響，為運(yùn)動(dòng)抗動(dòng)脈粥樣硬化提供實(shí)驗(yàn)支持并探索合適的運(yùn)動(dòng)時(shí)間。

1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象

雄性SD大鼠60只，9周齡，體重250±10g，為II級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，購于中南大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部。室溫20～24℃，自然光照，自由飲食、飲水，每籠5只飼養(yǎng)1周后用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 動(dòng)物模型的建立

依照參考文獻(xiàn)，給予AS、ASL、ASM和ASH組高脂飼料，高脂飼料配方:大鼠標(biāo)準(zhǔn)飼料中加1%膽固醇，0.35%膽酸鈉，5%豬油，0.61%丙基硫氧嘧啶。前三天按70萬IU/kg的總劑量分三次灌胃給予維生素D3。動(dòng)物建模時(shí)間為6周，6周后進(jìn)行動(dòng)物模型檢驗(yàn)。

1.3 動(dòng)物分組

于動(dòng)物模型建立實(shí)驗(yàn)前，隨機(jī)選取10只為對(duì)照組，未進(jìn)行動(dòng)物建模。建模成功大鼠隨機(jī)分為五組，C組 （正常對(duì)照組）、AS組 （動(dòng)脈粥樣硬化模型組）、ASS組 （動(dòng)脈粥樣硬化+30 min有氧運(yùn)動(dòng)）、ASM組 （動(dòng)脈粥樣硬化+60 min有氧運(yùn)動(dòng)）、ASL（動(dòng)脈粥樣硬化+90 min有氧運(yùn)動(dòng)），每組各10只。

1.4 有氧訓(xùn)練安排

以上動(dòng)物分組后進(jìn)行三天的跑臺(tái)訓(xùn)練，然后進(jìn)行正式運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)。根據(jù)參考文獻(xiàn)和本實(shí)驗(yàn)室的前期成果，大鼠跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度跑速為20 m/min。三個(gè)運(yùn)動(dòng)組的運(yùn)動(dòng)時(shí)間分別設(shè)計(jì)為30 min、60 min、和90 min。實(shí)驗(yàn)持續(xù)時(shí)間為4周，每周訓(xùn)練6天，每天一次訓(xùn)練。

1.5 測(cè)試方法

1.5.1 動(dòng)物模型檢驗(yàn)

動(dòng)物模型建立為6周時(shí)間，建模后每組取3只處死，提取主動(dòng)脈環(huán)，主動(dòng)脈切片常規(guī)HE染色，光鏡下觀察檢驗(yàn)?zāi)Ｐ徒⑹欠癯晒Α?/p>

1.5.2 動(dòng)物取材

訓(xùn)練結(jié)束后即刻用戊巴比妥鈉腹腔麻醉、宰殺，腹主動(dòng)脈取血。血液提取后靜置30 min，3000轉(zhuǎn)離心10 min，分離血清，-80超低溫冰箱保存，供實(shí)驗(yàn)分析。

1.5.3 NO和NOS測(cè)定

NO和NOS的測(cè)定均采用購自南京建成生物研究所的試劑盒測(cè)定，NO測(cè)定采用硝酸還原酶法，NOS測(cè)定采用比色法，實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格按試劑盒說明進(jìn)行。

1.5.4 ET的測(cè)定

放免法。試劑盒購自北京北方生物技術(shù)研究所，實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格按試劑盒說明進(jìn)行。

1.5.5 血漿ADMA和L-Arg測(cè)定

根據(jù)文獻(xiàn)，處理樣品。按1 ml血清加入20 mg的5-磺基水楊酸 （salicylsulfonic acid，SSA）沉淀蛋白，冰浴反應(yīng)10 min，離心 （2 000g，10 min），吸取上清，0.45μ m的濾膜過濾后待測(cè)。L-Arg和ADMA標(biāo)準(zhǔn)品用50%甲醇配成100 mg/mL左右濃度的儲(chǔ)備液，-20℃儲(chǔ)存。臨用前用人工腦脊液（NaCl 7.605 g，KCl 0.223g，NaH2PO4?2H2O 0.072 g，NaHPO4?12H2O 0.014 g，NaHCO32.1 g，MgCl2?6H2O 0.162 g，CaCl20.144 g，溶解后定容至1 000 mL，pH=7.4）稀釋后測(cè)定，稀釋倍數(shù)分別為80倍，200倍，400倍，800倍和1 600倍。將27 mg鄰苯二甲醛 （OPA）溶于0.5 mL甲醇中，再加入 2-巰基乙醇 （2-MCE）20μ L，加入0.1 mmol/L四硼酸鈉緩沖液 （pH=9.5）至5 mL制得衍生液，避光室溫保存。上樣前將20μ L標(biāo)準(zhǔn)液或樣品液與10μ L衍生液混勻，精確反應(yīng)90 s，進(jìn)樣20μ L。流動(dòng)相包括四種，各自成分如下:流動(dòng)相A:100%甲醇，流動(dòng)相B:純水，流動(dòng)相C:25%甲醇，3%四氫呋喃，72%0.05M PBS，流動(dòng)相D:70%甲醇，3%四氫呋喃，27%0.05M PBS，流動(dòng)相均經(jīng)0.45μ m濾膜過濾，超聲波脫氣后使用。采用Waters HPLC系統(tǒng)，分析柱為Inertsil ODS-2，流速為1 mL/min，溫度為30℃，熒光檢測(cè)調(diào)節(jié)為激發(fā)光338 nm、發(fā)射光425nm。

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出函數(shù)，將所測(cè)樣品的峰面積分別代入函數(shù)，計(jì)算 L-Arg及ADMA水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 動(dòng)物模型檢驗(yàn)

對(duì)照組動(dòng)脈各層結(jié)構(gòu)完整，無鈣化及脂肪沉淀。各造模組大鼠主動(dòng)脈切片可見內(nèi)膜細(xì)胞增生及內(nèi)皮下出現(xiàn)淡染的空泡等動(dòng)脈粥樣硬化的早期病變，有些部位可見中膜平滑肌細(xì)胞增生、排列紊亂或隆起呈斑塊狀結(jié)構(gòu)，有些部位中膜有明顯的鈣化形成，說明造模成功。

2.2 血清NO、NOS和ET濃度變化

實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，動(dòng)脈粥樣硬化各組的血清NO濃度無論在有氧訓(xùn)練前和運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練安排的各時(shí)段均明顯低于對(duì)照組，其差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著意義。無論運(yùn)動(dòng)時(shí)間的長短，均可明顯改善血管內(nèi)皮的NO釋放量，數(shù)據(jù)顯示各運(yùn)動(dòng)組的NO值均明顯高于安靜對(duì)照組和AS模型組。動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展過程中，NOS的活力降低，AS模型組的NOS活性明顯低于安靜對(duì)照組，而有氧練習(xí)，不論時(shí)間長短，均可改善NOS的活性，各運(yùn)動(dòng)組NOS活性明顯提高，與模型組比較有顯著意義。ET水平在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展過程中明顯升高，有氧練習(xí)顯著的降低血清的 ET水平。（見表1）

表1 血清NO、NOS和ET濃度變化 ，n=15）

表1 血清NO、NOS和ET濃度變化 ，n=15）

注:1）與對(duì)照組相比較P＜0.05; 2）與AS組比較P＜0.05

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2.3 血清ADMA、L-Arg濃度及ADMA/L-Arg比值變化

實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，L-Arg的水平各組都沒有明顯變化，動(dòng)脈粥樣硬化模型組的L-Arg和安靜對(duì)照組及各運(yùn)動(dòng)組比較逗沒有顯著差異。而血清ADMA水平在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病過程中有明顯上升，模型組和對(duì)照組相比有顯著差異。短時(shí)間的有氧練習(xí) （30 min）對(duì)血清ADMA的影響不大，ASS組和模型組相比較沒有顯著差異，而較長時(shí)間的有氧練習(xí)明顯降低血清ADMA水平，ASM組和ASL組與模型組相比較都有顯著差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示，動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病過程中 L-Arg/ADMA比值明顯降低，不同時(shí)間的有氧練習(xí)均可以提高這一比值。

表2 血清ADMA、L-Arg濃度及ADMA/L-Arg比值變化 （，n=15）

表2 血清ADMA、L-Arg濃度及ADMA/L-Arg比值變化 （，n=15）

注:1）與對(duì)照組比較P＜0.05;2）與AS及ASL組比較P＜0.05

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3 討論

大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)，規(guī)則、周期性、中小運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度的有氧運(yùn)動(dòng)可以預(yù)防動(dòng)脈硬化，改善心血管健康。Maiorana A教授認(rèn)為，運(yùn)動(dòng)改善心血管健康主要通過NO途徑實(shí)現(xiàn)，當(dāng)前關(guān)于運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)NO釋放改善心血管健康的關(guān)鍵問題是:何種強(qiáng)度以及多長時(shí)間的運(yùn)動(dòng)更為有利。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，動(dòng)物運(yùn)動(dòng)量和運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度的把握，成為能否得到合理的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的制約因素。本實(shí)驗(yàn)采用遞增運(yùn)動(dòng)負(fù)荷，靶強(qiáng)度為20 m/min，一次運(yùn)動(dòng)時(shí)間60 min的運(yùn)動(dòng)方案，根據(jù)加拿大學(xué)者Fernando研究的推斷，應(yīng)為中等強(qiáng)度有氧運(yùn)動(dòng)。經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明，這一強(qiáng)度的有氧練習(xí)可以有效改善動(dòng)脈粥樣硬化的大鼠的血清NO釋放量。

動(dòng)脈粥樣硬化 （athemsclerosis，AS）是嚴(yán)重危害人類健康的常見疾病之一，它是由內(nèi)皮細(xì)胞功能受損導(dǎo)致血管擴(kuò)張和收縮功能障礙引起的。ET是內(nèi)皮細(xì)胞分泌的一種最強(qiáng)的縮血管活性多肽，NO是一種很強(qiáng)的舒血管物質(zhì)。正常情況下，內(nèi)皮細(xì)胞所分泌的ET、NO應(yīng)該處于一種平衡狀態(tài)，AS的內(nèi)皮細(xì)胞功能異常主要表現(xiàn)為ET、NO的失衡。對(duì)于運(yùn)動(dòng)時(shí)內(nèi)皮細(xì)胞功能改變的AS，有學(xué)者研究指出:NO是一種體內(nèi)氧自由基清除劑，NO生成越少，則過氧化物生成越多，可促進(jìn)AS的形成。本研究顯示，大鼠在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展過程中，血清NO量明顯降低，血清ET含量明顯上升，這和大部分的報(bào)道一致。不同實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不同時(shí)間的有氧練習(xí)均有利于增加血清的NO釋放量，提示各種強(qiáng)度的有氧練習(xí)均有利于改善心血管健康。但是不同時(shí)間的有氧練習(xí)對(duì)ET釋放的影響不一，長時(shí)間練習(xí)的效果明顯優(yōu)于短時(shí)間的練習(xí)。

一氧化氮的生成主要通過NOS，利用L-Arg為底物合成。NO的生成依賴于NOS的活性和LArg的可利用度。一些學(xué)者假設(shè)給予L-Arg可能具有治療作用。，Adams等進(jìn)行的一項(xiàng)以經(jīng)血管造影證實(shí)的冠心病患者為研究對(duì)象的實(shí)驗(yàn)中，10名患者隨機(jī)分為2組.L-Arg組給予口服 L-Arg，連用3天，對(duì)照組給予安慰劑口服，結(jié)果顯示內(nèi)皮依賴性肱動(dòng)脈舒張功能在L-Arg組得以改善。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展過程中，NOS活性降低，各運(yùn)動(dòng)組均可明顯提高血清NOS活性，與模型組相比有顯著意義的差異。

內(nèi)源性NOS抑制物為L-精氨酸的同系物，其中研究較多的是不對(duì)稱二甲基精氨酸 （ADMA），其競(jìng)爭(zhēng)性抑制NOS活性，使NO的抗動(dòng)脈硬化作用減弱，導(dǎo)致動(dòng)脈硬化的發(fā)生、發(fā)展。自ADMA第一次被認(rèn)為是一氧化氮 （NO）途徑內(nèi)源性抑制劑以來，它在調(diào)節(jié)NO產(chǎn)生中所起的作用越來越受到重視。在動(dòng)脈中輸人ADMA能夠引起血管收縮。當(dāng)前的實(shí)驗(yàn)和l臨床數(shù)據(jù)表明ADMA濃度的輕微改變能顯著影響血管NO的產(chǎn)生，血管緊張度和全身血管抵抗。這表明ADMA可以作為一個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂的標(biāo)記。因此，L-Arg/ADMA比值被認(rèn)為是評(píng)價(jià)動(dòng)脈粥樣硬化風(fēng)險(xiǎn)的重要指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)，動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展過程中，血清L-Arg值變化很小。但是，本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)動(dòng)脈粥樣硬化模型組的血清ADMA值明顯升高，而L-Arg/ADMA比值下降。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，運(yùn)動(dòng)不會(huì)影響L-Arg水平，但是會(huì)降低 ADMA水平，從而改善 LArg/ADMA比值。

4 結(jié)論

4.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，無論多長時(shí)間的有氧運(yùn)動(dòng)均可以顯著提高血清NO水平并明顯提高血清NOS的含量;不同時(shí)間的有氧練習(xí)均降低血清ET水平，但是較長時(shí)間的運(yùn)動(dòng)效果更為明顯。

4.2 動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展過程中L-Arg濃度變化并不明顯，但是ADMA水平明顯上升。各種不同時(shí)間的有氧練習(xí)也不會(huì)改變血清L-Arg水平，但是較長時(shí)間的有氧練習(xí)有利于降低血清ADMA水平，因此可以有效改善L-Arg/ADMA比值。

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