解毒脫癮湯對(duì)嗎啡依賴大鼠腦內(nèi)多巴胺及其代謝產(chǎn)物的影響

朱成全，洪加津，白建萍，葉漢深

（解放軍第421醫(yī)院，廣東 廣州 510318）

解毒脫癮湯對(duì)嗎啡依賴大鼠腦內(nèi)多巴胺及其代謝產(chǎn)物的影響

朱成全，洪加津，白建萍，葉漢深

（解放軍第421醫(yī)院，廣東 廣州 510318）

目的 觀察解毒脫癮湯（JTD）對(duì)嗎啡依賴大鼠大腦內(nèi)不同腦區(qū)多巴胺及其代謝產(chǎn)物的影響。方法 采用大鼠嗎啡依賴戒斷模型，觀察解毒脫癮湯對(duì)嗎啡依賴大鼠大腦內(nèi)不同腦區(qū)多巴胺及其代謝產(chǎn)物的改變。結(jié)果 成癮組大鼠PFC和NAc的DA含量與對(duì)照組比較顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），而紋狀體的DA含量與對(duì)照組比較顯著降低，海馬的DA含量?jī)山M之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；解毒脫癮湯中、高劑量組與可樂定組均可降低海馬、PFC、NAc的DA含量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），但對(duì)紋狀體的DA含量影響不大，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；成癮組大鼠PFC和NAc的DOPAC含量與對(duì)照組比較顯著增高，成癮組大鼠紋狀體的DOPAC比對(duì)照組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），而兩組大鼠海馬中均未能檢測(cè)到DOPAC；解毒脫癮湯中、高劑量組與可樂定組均可降低PFC、NAc的DOPAC含量，對(duì)紋狀體的DOPAC含量影響不大，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 嗎啡依賴大鼠腦內(nèi)可能存在多巴胺及其代謝產(chǎn)物障礙，解毒脫癮湯可能通過改善嗎啡依賴大鼠多巴胺物質(zhì)含量變化，消除其戒斷癥狀，從而達(dá)到治療的目的。

解毒脫癮湯；嗎啡依賴；多巴胺；大鼠；神經(jīng)遞質(zhì)；黃芪；鉤藤；黃連

藥物濫用(成癮)是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，即由于長(zhǎng)期濫用成癮性物質(zhì)所引起的一種腦內(nèi)的神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)、生物化學(xué)和功能改變的慢性腦病。由于濫用的藥物都是神經(jīng)活性物質(zhì)，能改變腦遞質(zhì)的功能，故藥物依賴過程涉及腦功能的改變。解毒脫癮湯臨床主要用于戒毒治療，為進(jìn)一步探討其治療阿片類依賴的作用機(jī)制，我們觀察與嗎啡成癮大鼠相關(guān)的額葉皮質(zhì) (prefrontal codex，PFC)、海馬、伏隔核(nucleus accumbens，NAc)和紋狀體的DA及其代謝產(chǎn)物3，4-二羥苯酰乙酸(DOPAC)的變化，探討解毒脫癮湯對(duì)嗎啡成癮神經(jīng)遞質(zhì)的改變?，F(xiàn)將實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物 解毒脫癮湯由解放軍第421醫(yī)院提供，由黃芪、鉤藤、黨參、元胡、細(xì)辛、梔子、雞血藤、黃連、黃柏、生地、山藥、茯苓、丹皮、當(dāng)歸、川芎等16味藥組成，用時(shí)煎成濃縮液，2.0 g生藥/mL；鹽酸嗎啡注射液(沈陽第一制藥廠，批號(hào)060114)；鹽酸納洛酮注射液(北京華素制藥股份有限公司，批號(hào)為 0804031)；鹽酸可樂定片(北京第三制藥廠生產(chǎn)，批號(hào)770654)。

1.1.2 動(dòng)物 成年健康雄性wistar大鼠20只，體質(zhì)量180～220 g。購自南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心(動(dòng)物合格證號(hào)：2005A065，2005B01)。

1.1.3 試劑 DA和DOPAC標(biāo)準(zhǔn)品購自Sigma公司。甲醇為國(guó)產(chǎn)色譜純，高氯酸、檸檬酸三鈉、磷酸二氫鈉為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.4 儀器 色譜條件色譜柱 ODS C18分析柱 (4.6 toni×250 mil，5 Ixm)，熒光檢測(cè)器型號(hào)為：RF-10AXL。柱溫：常溫，熒光檢測(cè)波長(zhǎng) λEX=585 BITI，λEM=333 nm。流動(dòng)相(V∶V)：0.02 mol/L檸檬酸三鈉-0.05 mol/L磷酸二氫鈉∶甲醇=97∶3，流速：1.0 mL/min。進(jìn)樣量 30 μL。用外標(biāo)法定量，以峰面積表示其含量。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型建立 大鼠用劑量漸增法制作嗎啡成癮病理模型［1］，方法為：大鼠皮下注射，第1天10 mg/kg(bid)；然后隔日1次，每次增加10 mg/kg，至第6天末次注射50 mg/kg嗎啡，建立嗎啡依賴模型。而NS組則以NS代替嗎啡同法注射。最后1次注射后2 h，兩組分別隨機(jī)選取3只大鼠，按4 mg/kg注射鹽酸納洛酮行催促戒斷，觀察并記錄1 h內(nèi)戒斷癥狀及體質(zhì)量的變化情況。以改進(jìn)的柳田知司評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)記錄癥狀及體質(zhì)量變化進(jìn)行評(píng)分，作為判斷成癮的指標(biāo)。

1.2.2 動(dòng)物分組、給藥、采取標(biāo)本 將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分成6組：生理鹽水(NS)組、嗎啡+生理鹽水(NS)組、嗎啡+解毒脫癮湯低劑量（JTDD）組、嗎啡+解毒脫癮湯中劑量（JTDZ）組、嗎啡+解毒脫癮湯高劑量（JTDG）組和嗎啡+可樂定(CND)組，每組動(dòng)物數(shù)均為10只，雌雄各半。大鼠用劑量漸增法制作嗎啡成癮病理模型[1]，方法為：2 d內(nèi)皮下注射鹽酸嗎啡 8次，第 1天注射 6次，劑量分別為 10、15、20、25、30、35 mg/kg；第 2 天注射 2 次，劑量分別為 40，50 mg/kg；總劑量達(dá)225 mg/kg；而NS組則以NS代替嗎啡同法注射。另解毒脫癮湯低、中、高劑量各組還分別以濃縮液灌胃，劑量分別為 50、100、200 mg/kg；可樂定組灌胃鹽酸可樂定(CND)0.2 mg/kg，嗎啡+NS組等灌胃容量生理鹽水，每天給藥2次，共給藥2 d。每組各取10只大鼠迅速斷頭處死，參照大鼠腦立體定位圖譜，冰臺(tái)上迅速分離海馬、紋狀體、NAc和PFC腦組織，分別精確稱質(zhì)量，加入1 mL 0.1 moL/L高氯酸溶液，置入1 mL組織勻漿器中，冰浴下勻漿，高速冷凍離心機(jī)15 000 r/min 4℃離心30 min，取上清液置入1.5 mL離心管，于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)品曲線的制定 參照劉恭平等[2]的方法并適當(dāng)改進(jìn)。標(biāo)準(zhǔn)品配制：DA，DOPAC純品用0.1 moL/L高氯酸分別配成100 g/mL的儲(chǔ)備液，分裝后-80℃保存，臨用時(shí)用流動(dòng)相稀釋。DA 稀釋成 0.0125，0.025，0.05，0.1和0.2 μg/mL；DOPAC 稀 釋 成 0.05，0.1，0.2，0.4，0.8，1.6 μg/mL。試驗(yàn)用水均為超純水。在上述色譜條件下，分別取30 μL進(jìn)樣檢測(cè)，重復(fù)3次，取峰面積的平均值，以濃度Y對(duì)峰面積X做回歸。

1.2.4 樣品HPLC檢測(cè) 按上述方法，分別對(duì)兩組大鼠不同腦區(qū)的DA和DOPAC進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定值再除以相應(yīng)腦組織的克數(shù)即為含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 嗎啡成癮模型大鼠的一般情況

隨機(jī)選取的大鼠注射納洛酮后1 h內(nèi)均出現(xiàn)濕狗樣顫抖、伸展、清理皮毛、站立、跳躍、齒顫、腹瀉和體質(zhì)量下降等戒斷癥狀，評(píng)分也明顯高于對(duì)照組。

2.2 解毒脫癮湯對(duì)嗎啡成癮模型不同腦區(qū)DA含量的影響

成癮組大鼠PFC和NAc的DA含量相對(duì)于對(duì)照組顯著增高(P＜0.01)；而紋狀體的DA含量與對(duì)照組比較顯著降低(P＜0.01)；海馬的DA含量?jī)山M之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。解毒脫癮湯中、高劑量組與可樂定組均可降低海馬、PFC、NAc 的 DA 含量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.05）。解毒脫癮湯各劑量組與可樂定組對(duì)紋狀體的DA含量影響不大，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果見表1。

表1 解毒脫癮湯對(duì)大鼠不同腦區(qū)DA含量的影響（±s，n=10，μg/g 濕質(zhì)量）

表1 解毒脫癮湯對(duì)大鼠不同腦區(qū)DA含量的影響（±s，n=10，μg/g 濕質(zhì)量）

注：與 Mor+NS 比較 *P＜0.05，**P＜0.01；與 NS 比較△△P＜0.01。

組別NS Mor+NS Mor+CND Mor+JTDD Mor+JTDZ Mor+JTDG海馬0.589±0.005 0.593±0.006△△0.595±0.003**0.584±0.006 0.562±0.006**0.579±0.004**額葉皮質(zhì)0.315±0.028 0.824±0.019△△0.672±0.028**0.784±0.015 0.562±0.023*0.436±0.013**伏隔核2.281±0.076 3.412±0.163△△2.781±0.159**3.156±0.188 2.648±0.179**2.407±0.162**紋狀體5.912±0.163 3.168±0.081 4.242±0.128 5.217±0.126 4.318±0.170 4.217±0.165

2.3 解毒脫癮湯對(duì)嗎啡成癮大鼠不同腦區(qū)DOPAC含量的影響

成癮組大鼠PFC和NAc的DOPAC含量與對(duì)照組比較顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；成癮組大鼠紋狀體的DOPAC比對(duì)照組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；而兩組大鼠海馬中均未能檢測(cè)到DOPAC。解毒脫癮湯中、高劑量組與可樂定組均可降低PFC、NAc的DA含量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.05）。解毒脫癮湯各劑量組及可樂定組對(duì)紋狀體的DA含量影響不大，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果見表2。

表2 解毒脫癮湯對(duì)大鼠不同腦區(qū)DOPAC含量的影響（±s，n=10，μg/gs濕質(zhì)量）

表2 解毒脫癮湯對(duì)大鼠不同腦區(qū)DOPAC含量的影響（±s，n=10，μg/gs濕質(zhì)量）

注：與 Mor+NS 比較 **P＜0.01，*P＜0.05；與 NS 比較△△P＜0.01。

組別NS Mor+NS Mor+CND Mor+JTDD Mor+JTDZ Mor+JTDG紋狀體1.164±0.024 0.429±0.027 0.826±0.028 0.789±0.026 0.618±0.017 0.617±0.016海馬------額葉皮質(zhì)0.031±0.002 0.122±0.014△△0.042±0.018**0.058±0.021*0.052±0.023*0.036±0.014**伏隔核0.669±0.225 0.712±0.012△△0.705±0.013**0.646±0.015**0.648±0.018**0.647±0.016**

3 討論

近年研究證實(shí)NAc與動(dòng)機(jī)行為和獎(jiǎng)賞行為密切聯(lián)系，是成癮藥物的作用基礎(chǔ)。海洛因的代謝產(chǎn)物通過阿片受體介導(dǎo)抑制了腹側(cè)被蓋區(qū)(ventral tegmental area，VTA)中間神經(jīng)元上的γ-氨基丁酸(γ-GABA)的釋放，從而解除了其對(duì)VTA多巴胺能神經(jīng)元向NAc等腦區(qū)投射DA的抑制作用[3]。研究發(fā)現(xiàn)嗎啡成癮過程中NAc內(nèi)的DA量呈明顯上升趨勢(shì)，證實(shí)了這個(gè)獎(jiǎng)賞通路的存在，NAc在海洛因獎(jiǎng)賞效應(yīng)中起關(guān)鍵作用[4]。NAc內(nèi)的DA在大鼠成癮后明顯升高，而其更新率反而比對(duì)照組下降，也許與其功能是相適應(yīng)的。與NAc相似，PFC也接受VTA的DA的投射，大鼠成癮后PFC的DA含量明顯上升，其更新率也明顯加快。PFC參與了物質(zhì)成癮相關(guān)的認(rèn)知、行為和情緒的變化的調(diào)節(jié)和控制。海馬是參與藥物成癮和條件線索學(xué)習(xí)和記憶過程的重要腦區(qū)[5]。

本研究發(fā)現(xiàn)嗎啡成癮過程中海馬中的DA含量并沒有明顯變化，也未能檢測(cè)到其代謝產(chǎn)物，能否說明嗎啡成癮過程中，DA不是參與海馬學(xué)習(xí)記憶相關(guān)突觸傳遞的主要神經(jīng)遞質(zhì)，有待于我們深入研究。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，解毒脫癮湯中、高劑量組均可降低均可降低海馬、PFC、NAc的DA及其代謝產(chǎn)物DOPAC含量；解毒脫癮湯各劑量組紋狀體的DA及其代謝產(chǎn)物DOPAC含量影響不大。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為阿片類物質(zhì)最易耗氣傷陰，損精耗液，依賴后可出現(xiàn)氣虛、精虧、血瘀、火旺等癥狀，嚴(yán)重時(shí)元?dú)夂慕?，臟腑陰陽俱損。根據(jù)其病因病機(jī)我們擬定解毒脫癮湯[6]，以黃連、黃柏、梔子清熱解毒，排除毒邪為君藥；生地、丹皮涼血清營(yíng)，共為臣藥；川烏、細(xì)辛既可溫腎壯陽以逐內(nèi)寒，又可合元胡、鉤藤舒筋通絡(luò)而止痛，當(dāng)歸、黃芪、生地、雞血藤，可益氣養(yǎng)陰生血，以上諸藥共為輔佐；另酌加山藥、茯苓補(bǔ)脾益氣而扶助后天之本，使氣血生化之源得以補(bǔ)益，以此為使藥。本研究結(jié)果表明，解毒脫癮湯對(duì)嗎啡依賴大鼠相關(guān)腦區(qū)的多巴胺及其代謝產(chǎn)物有一定的調(diào)節(jié)作用，但其具體作用機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

[1]陳艷明，田育望.碩苞薔薇化學(xué)成分對(duì)抗嗎啡戒斷癥狀的實(shí)驗(yàn)研究[J].湖南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2000，21（1）：6-7.

[2]劉恭平，石年，梁駿華，等.擬除蟲菊酯對(duì)大鼠腦黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)多巴胺及其代謝產(chǎn)物的影響 [J].中華勞動(dòng)衛(wèi)生職業(yè)病雜志，2005，22(5)：368-370.

[3]Agarwal RK,Pandey US,Dixit,et al.Role of dopaminergic system in opioid-induced cardiovascular responses in dog[J].Indian J Med Sci,1989,43(12):323.

[4]Aley KO,Levine JD.Different mechanism mediate development and expression of tolerance for peripheral mu-opioid antinociception in rat[J].J Neurosci,1997,17(20):8 018.

[5]De Souza Silva MA，Mattem C，Hacker R，et a1.Intranasal administration of the dopaminergic agonists L-DOPA，amphetamine，and cocaine increases dopam ine activity in the neostriatum：a microdialysis study in the rat[J].J Neurochem，1997，68(1)：233-239.

[6]蒙桂珍，李 銳，周莉玲，等.解毒脫癮湯對(duì)嗎啡依賴性大鼠鎮(zhèn)痛及生殖功能的影響[J].廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，19（3）：218-220.

Effects of Jiedu Tuoyin decoction on brain dopamine and its metabolites in morphinistic rats

ZHU Cheng-quan,HONG Jia-jin,BAI Jian-ping,YE Han-shen
(421 Hospital of People's Liberation Army,Guangzhou,Guangdong 510318,China)

ObjectiveTomeasure theeffectsofJiedu Tuoyin decoction (JTD)on brain dopamine and its metabolites in morphinistic rats.MethodsThe detoxification models of morphinistic rats were used to observe the effects of JTD on the brain dopamine and itsmetabolitesin differentbrain regions.ResultsCompared with the controlgroup,the DA content of PFC and the NAc in addicted group were significantly higher(P＜0.01),while the DA content in striatum was lower,and the DA content in the hippocampus was not significant;in the middle-dose and high-dose of JTD groups and the clonidine group,the DA content of hippocampus,PFC and NAc lowered(P＜0.01);the DA content in the striatum was not so affected in the each dose of JTD groups and the clonidine group,which was no statistical significant difference;compared with the control group,the DOPAC content of PFC and NAc in addicted group were significantly higher,and DOPAC in striatum was lower(P＜0.01),while DOPAC were not detected in the hippocampus;all the DA contents of PFC and NAc in the middle-dose and high-dose of JTD groups and the clonidine group lowered,and the striatal DA content was not influenced in those groups,the statistics difference was no significant.ConclusionThere may exists obstacles of brain dopamine and its metabolites in brain of morphinistic rats,and JTD may be effective to improve the morphine content of dopamine material changes for elimination ofthe withdrawal symptoms.

Jiedu Tuoyin decoction;morphine dependence;dopamine;rats;neurotransmitter;Astragalus mongholicus;ramuliet spina uncariae;coptis

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2010.11.009.028.03

2009-12-10

海軍衛(wèi)生部科研基金資助項(xiàng)目(00HW04)。

朱成全(1969-)，男，安徽望江人，副主任醫(yī)師，主要從事中西醫(yī)結(jié)合腦病研究。

（本文編輯 彭芝配）