康腦液 1號對大鼠腦缺血再灌注細(xì)胞凋亡及GFAP表達(dá)的影響

趙寶民 鄒玉安 薛茜 薄愛華 楊向方

康腦液 1號為臨床治療缺血性腦血管病的經(jīng)驗(yàn)組方,臨床療效良好。以往藥理研究證實(shí)康腦液 1號組方中單藥如黃芪、三七、葛根等具有降低血液黏度、改善腦血流、改善微循環(huán)、降低血脂及抑制炎性反應(yīng)等作用[1,2]。缺血再灌注后損傷刺激膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性活化、增殖,進(jìn)而形成膠質(zhì)瘢痕,同時(shí)增加細(xì)胞凋亡。膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)的表達(dá)是星形膠質(zhì)細(xì)胞的特異性標(biāo)志。本研究通過觀察康腦液 1號對局灶性腦缺血再灌注后缺血半暗帶、梗死灶中心細(xì)胞凋亡及 GFAP表達(dá)的影響,以探討其可能的腦保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 健康雄性SD大鼠180只,體重(270±20)g,SPF/UAF級,購自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部,許可證號：SCXK(京)2006-0008。稱重后隨機(jī)分為 5組,每組 36只。(1)假手術(shù)組;(2)模型組;(3)鹽酸法舒地爾組(6.3 mg?100g-1? d-1);(4)康腦液 1號 A組(1.5 g? 100 g-1? d-1);(5)康腦液 1號 B組(30g? 100 g-1? d-1)。以顆粒型大鼠繁殖飼料喂養(yǎng)(北京康藍(lán)生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)),飲用去離子水,室溫控制在 22～25℃,正常晝夜節(jié)律。

1.2 藥物與試劑 鹽酸法舒地爾注射液(川威)：天津紅日藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)(國藥準(zhǔn)字 H 20040356,產(chǎn)品批號：060608,規(guī)格 2ml∶30mg)。栓線購自北京沙東生物技術(shù)有限公司[產(chǎn)品編號 2432-100,線長 40mm,線身直徑 0.24mm,頭端直徑(0.32±0.02)mm]。試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 腦缺血再灌注損傷模型的制備 采用改進(jìn) Longa線栓法[3]制備大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈腦缺血再灌注模型。SD大鼠術(shù)前 24 h禁食,隨意進(jìn)水。用 7%水合氯醛(350mg/kg)腹腔注射麻醉,不結(jié)扎翼顎動(dòng)脈,均缺血 2 h,術(shù)后單籠、分組給藥。假手術(shù)組將栓線插入頸內(nèi)動(dòng)脈但不入顱,2 h后退回至頸外動(dòng)脈內(nèi),其余步驟同實(shí)驗(yàn)組。

1.4 用藥方法 康腦液 1號,由黃芪、三七、葛根等組成。飲片購自河北北方學(xué)院第一附屬醫(yī)院中藥房。常規(guī)煎煮濃縮至4 g/m l。鹽酸法舒地爾組采用腹腔注射法給藥,康腦液 1號組采用灌胃法給藥,每天早晨給藥 1次,均連續(xù)給藥 7 d,最后 1次給藥后 1h實(shí)施腦缺血再灌注手術(shù)缺血 2h,術(shù)后繼續(xù)給藥至再灌注各時(shí)間點(diǎn)(1、3、7 d);給藥劑量按大鼠與人體表面積等效劑量折算。康腦液 1號 A組劑量為 15 g? g-1?d-1,B組劑量為 30g?g-1?d-1。假手術(shù)組和模型組動(dòng)物也于 1、3、7 d給予等量去離子水灌胃。于術(shù)后分別取材。觀察 5組大鼠術(shù)畢清醒后的 Longa評分和術(shù)后的活動(dòng)度變化。

1.5 動(dòng)物灌注固定與取材 將實(shí)驗(yàn)大鼠缺血 2 h,至再灌注所需時(shí)間點(diǎn)時(shí),7%水合氯醛腹腔注射麻醉仰臥位固定,暴露心臟。將灌注針從左心室心尖部插入直至升主動(dòng)脈并固定,灌注肝素化 0.9%氯化鈉溶液 150m l,同時(shí)剪開右心房,將全身血液沖洗干凈,然后應(yīng)用 4%多聚甲醛 200 ml(4℃)心臟灌注固定30min。快速斷頭取腦,從前向后將腦組織分為 A、B、C、D、E五等分,切成厚度約2～3mm的腦片,選取 C腦片,入 4%多聚甲醛固定液中繼續(xù)固定24 h。

1.6 TTC染色和腦梗死面積測定 缺血 2 h再灌注 24 h后,每組隨機(jī)抽取 6只大鼠,快速斷頭取出鼠腦,置冰箱(-20℃)內(nèi) 10min后,切除嗅腦,取冠狀面從前向后將腦組織分為A、B、C、D、E五等分,切成厚度 2～3mm厚的腦片,選取 C腦片,將切片迅速置于 2%TTC溶液(37℃水浴)中避光條件下染色30min。正常腦組織染成紅色,缺血區(qū)呈灰白色,界線清晰。4%多聚甲醛固定 24 h。數(shù)碼相機(jī)攝片,計(jì)算機(jī)圖像分析,求得TTC染色兩側(cè)正常區(qū)與梗死灶的面積。以缺血對側(cè)腦片的面積減去缺血側(cè) TTC染色正常區(qū)的面積求得腦梗死面積。

1.7 HE染色、細(xì)胞凋亡和免疫組化測定 常規(guī)乙醇脫水、二甲苯透明,石蠟包埋,切片厚度 5μm,4℃儲存?zhèn)溆?。HE染色觀察病理形態(tài),免疫組織化學(xué)染色法采用 SP法,操作嚴(yán)格按說明書進(jìn)行,DAB顯色,常規(guī)脫水、透明、封片。用已知陽性切片作為陽性對照,PBS替代一抗作為陰性對照。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用 SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件,計(jì)量資料以±s表示,組間比較采用單因素方差分析,P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能行為學(xué)評分及腦梗死體積 缺血再灌注 6 h即可看到明顯梗死灶,累及右側(cè)大腦半球基底節(jié)區(qū)、額頂葉皮層及海馬區(qū),隨再灌流時(shí)間的延長梗死體積百分比逐漸增大,至缺血再灌注 24h時(shí),梗死灶占C腦片面積百分比達(dá)(43.0±0.7)%?？的X液 1號A、B組達(dá)(35.0±0.4)%?？的X液 1號A、B組比模型組梗死體積明顯減小,且神經(jīng)功能行為學(xué)評分與其余各組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表 1。

2.2 病理組織學(xué)改變 高倍光鏡下,(1)假手術(shù)組：大腦組織結(jié)構(gòu)完整,無梗死灶及水腫。神經(jīng)細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞未見異常。胞膜、核膜、核仁清晰。(2)模型組：缺血第 1天,缺血對側(cè),細(xì)胞形態(tài)正常。缺血側(cè)皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量明顯減少,排列紊亂,組織間隙水腫嚴(yán)重。缺血半暗帶明顯,神經(jīng)細(xì)胞稍小,形態(tài)基本正常;缺血灶中心區(qū)神經(jīng)細(xì)胞體積明顯縮小,部分細(xì)胞呈三角形,膠質(zhì)細(xì)胞固縮。缺血第 7天神經(jīng)細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞及毛細(xì)血管、小血管與周圍腦間質(zhì)的間隙顯著增大,間質(zhì)疏松。病灶中心區(qū)隨時(shí)間延長出現(xiàn)大量液化性壞死灶及囊性變,后期呈網(wǎng)狀改變,殘存細(xì)胞很少。(3)康腦液 1號 2組及鹽酸法舒地爾組：在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)與模型組相比,神經(jīng)元形態(tài)改變較輕,胞體完整,突起較清楚,基本保持完整。可見尚存的大腦皮質(zhì)的正常神經(jīng)元排列結(jié)構(gòu),且組織間隙水腫較模型組明顯減輕,神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞和血管大量變性壞死等缺血性改變和炎性反應(yīng)明顯輕于模型組。5組病理組織學(xué)改變提示大鼠 MCAO模型制備成功。

2.3 TUNEL凋亡和免疫組化結(jié)果 光鏡下(×400)在梗死灶及周邊區(qū)各隨機(jī)選取 10個(gè)互不重疊視野,計(jì)數(shù)平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差,計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞核內(nèi)存在棕黃色顆粒者為凋亡細(xì)胞。各組缺血對側(cè)半球腦組織切片中可見少量陽性細(xì)胞。模型組缺血半球凋亡細(xì)胞散布于整個(gè)缺血區(qū)內(nèi),病灶邊緣可見較多的陽性細(xì)胞而病灶中心陽性細(xì)胞數(shù)較少。康腦液 1號 2組病灶邊緣可見少量陽性細(xì)胞,而病灶中心可見較多陽性細(xì)胞,與其余各組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。假手術(shù)組僅有少數(shù)陽性細(xì)胞見表 2、3。模型組缺血梗死邊緣區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞 GFAP的表達(dá)隨著再灌注時(shí)間的延長而逐漸升高,7 d逐漸達(dá)到高峰,與假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。而梗死灶中心 GFAP的表達(dá)很少。鹽酸法舒地爾組與模型組的 GFAP表達(dá)相近?？的X液 1號 2組梗死灶周邊 GFAP的表達(dá)很少;而梗死灶中心GFAP的表達(dá)較多,與模型組、鹽酸法舒地爾組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。康腦液 1號 2組的影響：減少缺血半暗帶神經(jīng)元凋亡而 GFAP的表達(dá)較少;誘導(dǎo)病灶中心神經(jīng)元凋亡減少壞死而 GFAP的表達(dá)較多,康腦液 1號各組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表 4、5。

表 1 康腦液 1號對缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能行為學(xué)評分的影響n=30,±s

表 1 康腦液 1號對缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能行為學(xué)評分的影響n=30,±s

注：與假手術(shù)組比較,＊P＜0.05;與模型組比較,#P＜0.05

組別 再灌注后神經(jīng)功能行為學(xué)評分6h 24 h 72 h假手術(shù)組 0 0 0模型組 1.9±0.7＊ 2.1±0.7＊ 2.6±0.5＊鹽酸法舒地爾組 1.8±0.6 1.9±0.7 2.4±0.5康腦液 1號 A組 1.2±0.4＊# 1.4±0.5＊# 1.1±0.3＊#康腦液 1號 B組 1.2±0.4＊# 1.3±0.5＊# 1.1±0.3＊#

表 2 康腦液 1號對腦缺血再灌注大鼠梗死灶周邊神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響n=30,±s

表 2 康腦液 1號對腦缺血再灌注大鼠梗死灶周邊神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響n=30,±s

注：與假手術(shù)組比較,＊P＜0.05;與模型組比較,#P＜0.05

組別 梗死灶周邊神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)目(個(gè)/400倍視野)1 d 3 d 7 d假手術(shù)組 1.0±0.7 0.9±0.6 1.1±0.7模型組 51.6±3.5＊ 7.3±1.6＊ 2.7±1.2＊鹽酸法舒地爾組 44.7±7.2 5.5±1.8 2.4±1.0康腦液 1號 A組 27.4±1.3＊# 4.9±1.3＊# 1.7±0.8＊#康腦液 1號 B組 27.2±0.8＊# 4.8±1.1＊# 1.8±0.8＊#

表 3 康腦液 1號對腦缺血再灌注大鼠梗死灶中心神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響n=30,±s

表 3 康腦液 1號對腦缺血再灌注大鼠梗死灶中心神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響n=30,±s

注：與假手術(shù)組比較,＊P＜0.05;與模型組比較,#P＜0.05

組別 梗死灶中心神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)目(個(gè)/400倍視野)1 d 3 d 7 d假手術(shù)組 1.0±0.7 0.9±0.6 1.1±0.7模型組 1.1±0.3＊ 1.3±0.5＊ 1.1±0.6＊鹽酸法舒地爾組 1.2±0.4 1.3±0.5 1.2±0.6康腦液 1號 A組 17.3±0.8＊# 8.0±1.0＊# 4.5±1.4＊#康腦液 1號 B組 17.9±2.5＊# 8.2±2.0＊# 4.7±1.2#

表 4 康腦液 1號對缺血再灌注大鼠梗死灶周邊 GFAP表達(dá)的影響n=30,±s

表 4 康腦液 1號對缺血再灌注大鼠梗死灶周邊 GFAP表達(dá)的影響n=30,±s

注：與假手術(shù)組比較,＊P＜0.05;與模型組比較,#P＜0.05

組別 再灌注時(shí)間1 d 3 d 7 d假手術(shù)組 1.4±1.0 1.2±0.4 1.1±1.2模型組 9.5±2.2＊ 20.1±1.7＊ 33.2±3.6＊鹽酸法舒地爾組 9.3±3.2 19.9±1.4 31.7±2.9康腦液 1號 A組 7.1±1.7＊△ 8.7±0.8＊# 10.5±2.2＊#康腦液 1號 B組 7.4±1.5＊#△ 8.8±0.9＊#△ 11.2±1.8＊#△

表 5 康腦液 1號對缺血再灌注大鼠梗死灶中心 GFAP表達(dá)的影響n=30,±s

表 5 康腦液 1號對缺血再灌注大鼠梗死灶中心 GFAP表達(dá)的影響n=30,±s

注：與假手術(shù)組比較,＊P＜0.05;與模型組比較,#P＜0.05

組別 再灌注時(shí)間1 d 3 d 7 d假手術(shù)組 1.2±0.9 1.0±0.7 1.2±1.0模型組 9.0±1.8＊ 8.2±1.4＊ 7.6±1.9＊鹽酸法舒地爾組 7.5±2.8 7.3±0.5 7.1±1.4康腦液 1號 A組 5.7±1.8＊# 8.1±1.0＊# 11.8±2.2＊#康腦液 1號 B組 5.9±3.2＊# 8.0±0.8＊# 7.8±4.2＊#

3 討論

腦缺血再灌注后神經(jīng)元凋亡的發(fā)生既是凋亡相關(guān)基因表達(dá)的結(jié)果,又受許多內(nèi)外因素的調(diào)節(jié)。與凋亡基因激活、氧自由基、鈣超載、線粒體損傷導(dǎo)致細(xì)胞能量代謝障礙、凋亡蛋白因子及相關(guān)細(xì)胞因子過度表達(dá)有關(guān)。研究表明,缺血半暗帶的細(xì)胞損傷主要通過神經(jīng)元凋亡(apoptosis)途徑進(jìn)行[4,5]。最顯著發(fā)生凋亡的部位是缺血半暗帶及缺血敏感區(qū)(如海馬)等部位[6],腦缺血后細(xì)胞凋亡在缺血再灌注 30min即出現(xiàn),以 24～48 h凋亡細(xì)胞數(shù)目最多 ,可一直持續(xù)到再灌注 28 d[7]。

局灶性腦缺血再灌注損傷時(shí),星形膠質(zhì)細(xì)胞在缺血再灌注損傷刺激后表達(dá)明顯增高。在后期形成膠質(zhì)瘢痕,影響神經(jīng)功能的恢復(fù)。GFAP(膠質(zhì)纖維酸性蛋白)是星形膠質(zhì)細(xì)胞合成的一種重要骨架蛋白,是星形膠質(zhì)細(xì)胞的特異性標(biāo)記物,其表達(dá)量的多少可以反映星形膠質(zhì)細(xì)胞的功能狀態(tài)。缺血刺激使得星形膠質(zhì)細(xì)胞 GFAP活化表達(dá)增加,啟動(dòng)細(xì)胞周期的進(jìn)程。星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化狀態(tài)上調(diào)分泌神經(jīng)生長因子和成纖維細(xì)胞生長因子對神經(jīng)組織起營養(yǎng)支持保護(hù)作用,可能有利于神經(jīng)元的修復(fù)[8]。

星形膠質(zhì)細(xì)胞通過調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)外離子濃度,抑制鈣超載,拮抗興奮性氨基酸細(xì)胞毒性作用,抗氧化和自由基,釋放生物活性物質(zhì),提供能量等對神經(jīng)元起保護(hù)作用[9]。本研究結(jié)果顯示,假手術(shù)組各時(shí)間點(diǎn)大鼠凋亡細(xì)胞和 GFAP陽性細(xì)胞數(shù)變化不明顯。在壞死邊緣區(qū),模型組與鹽酸法舒地爾組各時(shí)間點(diǎn)凋亡細(xì)胞數(shù)不同程度減少。而GFAP陽性細(xì)胞數(shù)均不同程度增加,且第 7天時(shí)達(dá)高峰;壞死中心區(qū)域[10]凋亡細(xì)胞和 GFAP陽性細(xì)胞數(shù)較少?？的X液 1號各組能減少梗死灶周邊凋亡細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)GFAP,增加梗死灶中心區(qū)域凋亡細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)GFAP,引起星形膠質(zhì)細(xì)胞明顯的調(diào)節(jié)性活化,康腦液 1號對梗死灶周圍細(xì)胞凋亡和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的增生有顯著抑制作用,減少腦缺血再灌注后缺血半暗帶膠質(zhì)瘢痕,減少了梗死面積。能明顯減輕腦缺血再灌注導(dǎo)致的腦損傷,康腦液 1號各組與模型組梗死灶面積、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞 GFAP表達(dá)有顯著性差異。這些改變可能促進(jìn)神經(jīng)元的修復(fù)及重塑。

康腦液 1號,由黃芪、三七等組成,全方具益氣活血、熄風(fēng)清心、清熱利濕之效。因此我們推測,康腦液 1號在腦缺血再灌注后梗死灶的病理形態(tài)改變與調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞活性可能有關(guān),從而得以重塑梗死灶。有研究表明,抑制梗死灶周邊細(xì)胞凋亡和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的增生,對神經(jīng)功能的重塑有重要意義[11]。故調(diào)控缺血后細(xì)胞凋亡和星形膠質(zhì)細(xì)胞的活性可能是腦缺血治療的新方向。

1 李花,鄧常清,陳北陽,等.三七總皂苷對大鼠腦缺血再灌注后Caspase表達(dá)的影響.中國藥理學(xué)通報(bào),2006,22：189-193.

2 何蔚,朱遵平.三七總皂苷對大鼠腦梗死區(qū) ICAM-1表達(dá)和中性粒細(xì)胞浸潤的影響.中藥材,2005,28：403-405.

3 Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,et al.Reversiblem iddle Cerebral artery occlusion without craniectomy in rats.Stroke,1989,20：84-91.

4 Love S.Apoptosis and brain ischem ia.Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry,2003,27：267.

5 Yao H,Takasawa R,Fukudu K,et al.DNA fragmentation in ischem ic core and penumbra in focal cerebral ischem ia in rats.Mol Brain Res,2001,91：112-118.

6 Grotewold L,Ruther U.Fgfand Wnt signaling in programmed celldeath and chondrogenesis during vertebrate limb development：the role of Dickkopf-1.Int JDev Biol,2002,46：943-947.

7 Grotewold L,Ruther U.TheWnt antagonist Dickkopf-1 is regulated by Bmp signaling and c-Jun and modulates programmed cell death.EMBO J,2002,21：966-975.

8 楊忠,李紅麗,蔡文琴,等.兩種不同腦損傷后膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性變化的比較研究.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2001,9：1074-1077.

9 韓冬,馮加純.星形膠質(zhì)細(xì)胞對腦缺血后神經(jīng)元的保護(hù)作用.中國卒中雜志,2006,1：644-646.

10 KajiharaH,Tsutsum i E,Kinoshita A et al.Activated astrocytes with glycogen accumulation in ischem ic penumbra during the early stage of brain infarction：immunohistochemical and electron m icroscopic studies.Brain Res,2001,909：92-101.

11 Zhu Z,Zhang Q,Yu ZY,et al.Inhibiting Cell cycle progression reduces reactive astrogliosis initiated by scratch injury in vitro and by cerebral ischem ia in vivo.Glia,2006,55：546-558.