3種鑄造合金全冠戴用后K i67和P53蛋白在牙齦組織中的表達(dá)

喬廣艷 蘇儉生

（1.同濟(jì)大學(xué)口腔醫(yī)院 修復(fù)科，上海 200072；2.上海市口腔病防治院 修復(fù)科，上海 200001）

3種鑄造合金全冠戴用后K i67和P53蛋白在牙齦組織中的表達(dá)

喬廣艷1，2蘇儉生1

（1.同濟(jì)大學(xué)口腔醫(yī)院 修復(fù)科，上海 200072；2.上海市口腔病防治院 修復(fù)科，上海 200001）

目的 研究3種常用鑄造合金全冠戴用后Ki67、P53蛋白在牙齦組織中的表達(dá)，探討3種常用牙科鑄造合金的生物學(xué)性能。方法 對(duì)犬分別行58%金合金、不含鈹?shù)逆囥t合金、含鈹?shù)逆囥t合金鑄造全冠修復(fù)，建立實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。應(yīng)用免疫組化Envision二步法檢測戴冠前、戴冠后2周，1、2及3個(gè)月時(shí)Ki67、P53蛋白在牙齦組織中的表達(dá)。結(jié)果 含鈹?shù)逆囥t合金與不含鈹?shù)逆囥t合金鑄造全冠戴用后，Ki67、P53蛋白在牙齦組織的表達(dá)逐漸升高，戴冠1個(gè)月后達(dá)到最高，隨后逐漸降低；而58%金合金全冠戴用后，Ki67、P53蛋白的陽性表達(dá)率與空白對(duì)照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，隨時(shí)間延長也無明顯改變。結(jié)論 鎳鉻合金全冠戴用后，牙齦組織中Ki67、P53蛋白表達(dá)明顯，而58%金合金全冠戴用后表達(dá)不明顯。3種鑄造合金材料均未造成長時(shí)期的牙齦上皮異常增殖。

牙科鑄造合金； 牙齦組織； Ki67蛋白； P53蛋白

牙科鑄造合金因具有良好的硬度、耐磨性和韌性等綜合力學(xué)性能，廣泛應(yīng)用于固定義齒的冠、橋，活動(dòng)義齒的卡環(huán)、基托、支架，以及種植體等修復(fù)。而任何牙科鑄造合金從戴入口內(nèi)開始，便有金屬離子不斷釋出，當(dāng)釋出量逐漸聚積超過生理耐受量時(shí)，就可能導(dǎo)致機(jī)體局部或全身的損害。

臨床上，一些患者使用了牙科鑄造合金制作的修復(fù)體后會(huì)出現(xiàn)牙齦紅腫、充血，牙齦灰線，黏膜疼痛、苔蘚樣變等不良反應(yīng)。因此，對(duì)牙科鑄造合金生物相容性的研究，一直是國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注的熱點(diǎn)課題之一。本實(shí)驗(yàn)給犬進(jìn)行3種常用鑄造合金全冠修復(fù)，建立實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，采用免疫組化Envision二步法檢測Ki67、P53蛋白在牙齦組織中的表達(dá)，考察3種牙科鑄造合金材料（58%金合、不含鈹?shù)逆囥t合金和含鈹?shù)逆囥t合金）的生物學(xué)效應(yīng)，以期為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要材料與試劑

58%金合金（Ellephent公司，美國），不含鈹?shù)逆囥t合金（Matech’inc公司，美國），以及含鈹?shù)逆囥t合金（Aalba-Dent’inc公司，美國），主要成分見表1。鼠抗人Ki67和P53單抗（野生型，所用抗體稀釋滴度分別為：Ki67，1∶50；P53，1∶50），抗鼠Envision反應(yīng)液，鏈酶親和素-過氧化物酶復(fù)合物（strept avidin-biotin complex，SABC），DAB顯色劑，均由丹麥Dako公司出品。

表1 3種牙科鑄造合金材料組成成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)Tab 1 Components of three categories of dental casting alloys

1.2 研究對(duì)象

健康1歲齡雄性雜種犬，共12只，身體健壯，體重10 kg左右。在上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心無特殊病原條件下飼養(yǎng)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.3 牙齦組織切片的蘇木精-伊紅染色 對(duì)每個(gè)標(biāo)本，從上述8張切片中隨機(jī)選取1張進(jìn)行蘇木精-伊紅染色。

1.3.4 牙齦組織切片的免疫組化染色及結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) 采用免疫組織化學(xué)Envision二步法，對(duì)每個(gè)標(biāo)本的其余7張切片進(jìn)行染色，具體操作步驟按說明書進(jìn)行。用PBS液代替一抗作陰性對(duì)照，用丹麥Dako公司提供的陽性片作陽性對(duì)照，分別測定戴冠前、戴冠2周，1、2及3個(gè)月時(shí)牙齦組織中Ki67和P53蛋白的表達(dá)，其中鼠抗人Ki67（野生型）和鼠抗人P53單抗（野生型）所用的抗體稀釋滴度均為1∶50。

Ki67陽性染色僅見于細(xì)胞質(zhì)為陰性的細(xì)胞，其細(xì)胞核呈棕黃色，染色均勻或呈顆粒狀；P53陽性染色為細(xì)胞核和或質(zhì)染色同時(shí)呈橘紅色。利用Mias醫(yī)用圖像分析系統(tǒng)軟件，從每張切片中隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野，在每個(gè)高倍視野中隨機(jī)選取50個(gè)上皮細(xì)胞進(jìn)行觀察，計(jì)數(shù)陽性染色的細(xì)胞數(shù)，相加得陽性染色的細(xì)胞總數(shù)，然后按如下公式分別計(jì)算Ki67、P53蛋白的陽性表達(dá)率：陽性表達(dá)率=（陽性染色的細(xì)胞總數(shù)/500）×100%。

1.3.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SAS 9.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，其中計(jì)量資料的組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)，所有組間的比較采用方差分析。

2 結(jié)果

2.1 鑄造合金全冠戴用后Ki67蛋白在牙齦組織中的表達(dá)

58%金合金組在戴冠前、戴冠后2周，1、2及3個(gè)月時(shí)Ki67蛋白在牙齦組織中的表達(dá)率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=2.86，P＞0.05）。與戴冠前相比，不含鈹?shù)逆囥t合金組在戴冠后2周及戴冠后1個(gè)月時(shí)，Ki67蛋白的表達(dá)率呈逐漸上升趨勢；到戴冠后2個(gè)月與3個(gè)月時(shí)，Ki67蛋白的表達(dá)率雖有下降，但仍然高于戴冠前水平（F=59.60，P＜0.01）。含鈹?shù)逆囥t合金組各時(shí)間點(diǎn)Ki67表達(dá)率的變化與不含鈹?shù)逆囥t合金組基本一致，也出現(xiàn)了在戴冠后2周及戴冠后1個(gè)月時(shí)上升，而在戴冠后2個(gè)月與3個(gè)月時(shí)下降的趨勢（F= 115.24，P＜0.01，圖1）。

同時(shí)可以看出，戴冠前各組之間Ki67蛋白在牙齦組織中的表達(dá)率無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=2.89，P＞0.05）。在戴冠后2周、1、2及3個(gè)月時(shí)含鈹?shù)逆囥t合金組Ki67蛋白表達(dá)率均顯著高于不含鈹?shù)逆囥t合金組及58%金合金組（P均＜0.01），并且在戴冠后2周，1、2及3個(gè)月時(shí)不含鈹?shù)逆囥t合金組Ki67蛋白表達(dá)率也明顯高于58%金合金組（P均＜0.01，圖1）。

圖1 鑄造合金全冠戴用后Ki67蛋白在牙齦組織中表達(dá)率的比較Fig 1 Expression rate of Ki67 protein in gingival tissue after wearing different categories of casting alloy crowns

2.2 鑄造合金全冠戴用后P53蛋白在牙齦組織中的表達(dá)

58%金合金組在戴冠前、戴冠后2周，1、2及3個(gè)月各時(shí)間段P53蛋白在牙齦組織中的表達(dá)率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=0.28，P＞0.05）。與戴冠前相比，不含鈹?shù)逆囥t合金組在戴冠后2周及戴冠后1個(gè)月時(shí)，P53蛋白的表達(dá)率呈逐漸上升趨勢；到戴冠后2個(gè)月與3個(gè)月時(shí)，P53蛋白的表達(dá)率雖有下降，但仍然高于戴冠前水平（F=153.22，P＜0.01）。含鈹?shù)逆囥t合金組各時(shí)間點(diǎn)P53蛋白表達(dá)率變化與不含鈹?shù)逆囥t合金組基本一致，也呈現(xiàn)了在戴冠后2周及戴冠后1個(gè)月時(shí)上升，而在戴冠后2個(gè)月與3個(gè)月時(shí)下降的趨勢（F=140.27，P＜0.01，圖2）。

同時(shí)可以看出，戴冠前各組之間P53蛋白在牙齦組織中的表達(dá)率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=0.46，P＞0.05）。在戴冠后2周，1、2及3個(gè)月時(shí)含鈹?shù)逆囥t合金組P53蛋白表達(dá)率均顯著高于不含鈹?shù)逆囥t合金組及58%金合金組（P均＜0.01），并且在戴冠后2周，1、2及3個(gè)月時(shí)不含鈹?shù)逆囥t合金組P53蛋白表達(dá)率也明顯高于58%金合金組（P均＜0.01，圖2）。

圖2 鑄造合金全冠戴用后P53蛋白在牙齦組織中表達(dá)率的比較Fig 2 Expression rate of P53 protein in gingival tissue after wearing different categories of casting alloy crowns

2.3 鑄造合金全冠戴用后牙齦組織結(jié)構(gòu)的變化

58%金合金全冠戴用后各時(shí)間點(diǎn)的牙齦組織結(jié)構(gòu)與戴冠前（空白對(duì)照組）無明顯差異，均可見細(xì)胞界限清楚，基底細(xì)胞排列正常，未見炎性細(xì)胞浸潤，其中58%金合金全冠戴用后1個(gè)月的蘇木精-伊紅染色結(jié)果見圖3A；不含鈹?shù)逆囥t合金組與含鈹?shù)逆囥t合金組全冠戴用后2周、1個(gè)月時(shí)牙齦上皮的炎癥反應(yīng)均逐漸活躍，均可見細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂，細(xì)胞界限不清，基底細(xì)胞水腫，出現(xiàn)大量中性粒細(xì)胞浸潤，其中含鈹?shù)逆囥t合金全冠戴用后1個(gè)月的蘇木精-伊紅染色結(jié)果見圖3B；不含鈹?shù)逆囥t合金組與含鈹?shù)逆囥t合金組全冠戴用后2、3個(gè)月時(shí)炎癥反應(yīng)均轉(zhuǎn)入慢性炎癥期并趨于穩(wěn)定，均可見皮下有散在的淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞浸潤，其中含鈹?shù)逆囥t合金全冠戴用后2個(gè)月的蘇木精-伊紅染色結(jié)果見圖3C。

3 討論

近年來研究[1]發(fā)現(xiàn)，Ki67是一種與細(xì)胞增殖密切相關(guān)的核抗原，Ki67表達(dá)的高低反映了細(xì)胞增殖狀態(tài)，因此是目前應(yīng)用最廣泛的增殖細(xì)胞標(biāo)記之一。Ki67抗原對(duì)蛋白酶非常敏感，半衰期僅為1 h或更短，故在細(xì)胞有絲分裂G0期以外各期中均可檢測到Ki67抗原，能反映全部增殖細(xì)胞的數(shù)量，因此，Ki67作為一種可檢測細(xì)胞增殖狀態(tài)的指標(biāo)，具有準(zhǔn)確、可靠的優(yōu)點(diǎn)[2]。p53基因是一種重要的腫瘤抑制基因，參與細(xì)胞生長的正常調(diào)控，將DNA受損的細(xì)胞阻滯在G1期，使細(xì)胞在進(jìn)入S期前修復(fù)受損的DNA，阻止突變的形成。而p53基因的異常（如突變）可使P53蛋白發(fā)生異常，在細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性增強(qiáng)，失去抑制細(xì)胞增殖的作用，而有利于細(xì)胞增殖，細(xì)胞增殖失控則最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。目前認(rèn)為p53基因突變可能是細(xì)胞生物學(xué)行為改變的標(biāo)志之一[3]。

牙科鑄造合金在口腔內(nèi)可能導(dǎo)致的不良生物學(xué)反應(yīng)幾乎都是因合金金屬離子的析出而引起的[4]。牙科鑄造合金暴露于口腔環(huán)境中，將與牙齦組織、體液（唾液、血液）及口腔菌群直接接觸，發(fā)生電化學(xué)腐蝕，出現(xiàn)孔蝕現(xiàn)象，引起金屬離子析出[5]。金屬離子的析出對(duì)牙齦組織產(chǎn)生直接或間接的刺激作用，造成牙齦細(xì)胞營養(yǎng)障礙，細(xì)胞凋亡或死亡，再加上巨噬細(xì)胞吞噬析出離子等顆粒狀物質(zhì)，從而介導(dǎo)組織細(xì)胞的免疫反應(yīng)，引起牙齦炎癥反應(yīng)，從而細(xì)胞出現(xiàn)反應(yīng)性增殖[6]。

本實(shí)驗(yàn)顯示，不含鈹?shù)逆囥t合金組與含鈹?shù)逆囥t合金組全冠戴用2周、1個(gè)月時(shí)，牙齦組織炎癥反應(yīng)逐漸活躍，細(xì)胞結(jié)構(gòu)混亂、細(xì)胞界限不清，基底細(xì)胞水腫，大量中性粒細(xì)胞浸潤。戴冠2、3個(gè)月時(shí)，炎癥反應(yīng)趨于穩(wěn)定，轉(zhuǎn)入慢性炎癥期，皮下有散在淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞浸潤。同時(shí)炎癥反應(yīng)明顯時(shí)Ki67及P53蛋白呈較高表達(dá)，炎癥反應(yīng)穩(wěn)定時(shí)呈較低表達(dá)，可見牙齦上皮細(xì)胞增殖與牙齦炎癥反應(yīng)緊密相關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)Ki67及P53蛋白表達(dá)結(jié)果顯示，不同鑄造合金全冠材料和戴冠時(shí)間均會(huì)影響相應(yīng)區(qū)域牙齦上皮細(xì)胞的增殖和牙齦炎癥反應(yīng)。從材料角度分析，含鈹?shù)逆囥t合金全冠和不含鈹?shù)逆囥t合金全冠在對(duì)應(yīng)區(qū)域牙齦組織中Ki67及P53蛋白表達(dá)較高，引起較明顯的牙齦上皮細(xì)胞增殖和牙齦炎癥反應(yīng)；而58%金合金全冠未引起明顯的牙齦上皮細(xì)胞增殖和牙齦炎癥反應(yīng)。這與以往的不同合金金屬離子析出實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致：金合金具有良好的耐腐蝕性能，不易析出金屬離子；鎳鉻合金中加入鈹容易導(dǎo)致合金表面的保護(hù)性氧化層開裂[7]，降低鎳鉻合金的耐腐蝕性能，析出更多的金屬離子，從而引起明顯的牙齦上皮細(xì)胞增殖和牙齦炎癥反應(yīng)。從戴冠時(shí)間角度分析，含鈹?shù)逆囥t合金全冠和不含鈹?shù)逆囥t合金全冠戴用后，Ki67、P53蛋白的陽性表達(dá)率逐漸升高，戴冠1個(gè)月后達(dá)到最高，隨后逐漸降低，戴冠2、3個(gè)月時(shí)牙齦組織中Ki67及P53蛋白表達(dá)率降低。這與以往合金戴用后金屬離子釋出速度的研究結(jié)果相一致：合金戴用2個(gè)月后因?yàn)楹辖鸨砻嬷饾u鈍化，而生成的鈍化膜對(duì)材料表面起保護(hù)作用，合金的腐蝕速度減慢[8]，使得牙齦上皮細(xì)胞增殖和牙齦炎癥反應(yīng)趨于穩(wěn)定。這與蘇儉生等[9]報(bào)道對(duì)犬進(jìn)行不同材料牙科鑄造合金全冠修復(fù)，應(yīng)用免疫組化方法檢測增殖細(xì)胞核抗原、B細(xì)胞白血病/淋巴瘤基因2蛋白在牙齦組織中表達(dá)的結(jié)果一致。

細(xì)胞增殖與凋亡是組織正常生長、行使功能的2個(gè)基本要素，二者互相制約，處于動(dòng)態(tài)平衡中，細(xì)胞組織凋亡或受損至細(xì)胞死亡則由增殖來補(bǔ)充，以保持正常細(xì)胞數(shù)目及體積；平衡失調(diào)則導(dǎo)致異常增殖。本研究表明，含鈹?shù)逆囥t合金與不含鈹?shù)逆囥t合金全冠戴用后引起了明顯的牙齦上皮細(xì)胞增殖和炎癥反應(yīng)，生物相容性較差；而58%金合金全冠戴用后并未引起明顯的牙齦上皮增殖和炎性反應(yīng)，生物相容性較好。

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（本文編輯 湯亞玲）

Expression of Ki67 and P53 proteins in gingival tissue after wearing casting alloy crowns

QIAO Guangyan1，2,SU Jian-sheng1.（1.Dept.of Prosthodontics,School of Stomatology,Tongji University,Shanghai200072，China;2.Dept.of Prosthodontics,Shanghai Stomatology of Dental Clinic,Shanghai200001,China）

ObjectiveThe aim of the study was to detect the expression of Ki67 and P53 proteins in the gingival tissue before and after wearing three kinds of dental casting alloy crowns.MethodsThe three kinds of dental casting alloys（58%golden alloy,NiCr alloy,NiCr alloy excluding Be）were used to make full crowns for 3 dogs in each group.Another 3 dogs were taken as control.The immunohistochemistry Envision method was used to measure the expression of Ki67 and P53 proteins in the gingival tissue before wearing the crowns,2 weeks,1 month,2 months,3 months after wearing the crowns.Results The expression of Ki67 and P53 proteins in gingival tissue increased 1 month after wearing NiCr alloy and NiCr alloy excluding Be,then decreased gradually.And the expression of Ki67 and P53 proteins in 58%golden alloy group was similar to that in control.No pathological change was observed in all samples.ConclusionTwo kinds of NiCr alloy crowns both can increase the expression of Ki67 and P53 proteins in gingival tissue,but 58%golden alloy crowns can not.So compared with NiCr alloy crowns,58% golden alloy crowns have better biological properties.And none of three kinds of dental alloy crowns may induce long-term abnormal proliferation in gingival tissue.

dental casting alloys； gingival tissue； Ki67 protein； P53 protein

R 783

A

10.3969/j.issn.1000-1182.2010.05.024

1000－1182（2010）05－0547-04

2009-11-25；

2010-03-02

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（30970726）

喬廣艷（1978—），女，江蘇人，主治醫(yī)師，博士

蘇儉生，Tel：021-66311629