轉(zhuǎn)人血清白蛋白基因奶牛多重PCR快速檢測方法的建立

朱振營,林祥梅,劉 建*,吳紹強,仇松寅,王建武,薛振華

(1.中國檢驗檢疫科學研究院 動植物檢疫研究所,北京100029;2.中國農(nóng)業(yè)大學農(nóng)業(yè)生物技術國家重點實驗室 北京100193,3.北京市畜牧獸醫(yī)總站,北京100107)

1982年“碩鼠”的問世[1],使轉(zhuǎn)基因動物成為當今生命科學發(fā)展中的熱門領域。1997年世界首例體細胞克隆綿羊“多莉”的誕生,促進了轉(zhuǎn)基因技術在大動物方面的廣泛應用。目前國內(nèi)外已成功研制多種用于生產(chǎn)藥用或食用蛋白、提高瘦肉率、改善營養(yǎng)、增強抗病力的轉(zhuǎn)基因豬、牛、羊[3-8]。2006年GTC公司轉(zhuǎn)基因克隆羊生產(chǎn)的藥物抗凝血酶Ⅲ(商品名:ATryn)在歐洲上市,2009年在美國上市,標志著轉(zhuǎn)基因動物應用正走向產(chǎn)業(yè)化道路。

由于轉(zhuǎn)基因生物及其產(chǎn)品存在風險,轉(zhuǎn)基因生物及產(chǎn)品的管理一直受到各國政府的高度重視。而建立規(guī)范、準確、快速的轉(zhuǎn)基因成分檢測技術,是維護消費者知情同意權和在國際貿(mào)易中維護國家利益的重要保障。

轉(zhuǎn)基因植物檢測技術的研究已開展多年,常用的檢測技術包括:第一類是在整合水平上進行的檢測;第二類是在轉(zhuǎn)錄水平上進行的檢測;第三類是在表達水平上進行的檢測。國際上比較認同的檢測技術是利用PCR方法對外源基因進行整合水平檢測[8]。

目前對具有商品化前景的轉(zhuǎn)基因家畜的檢測平臺尚待建立,本研究以通過體細胞核移植技術制作的轉(zhuǎn)人血清白蛋白基因的奶牛[7]為研究對象,針對內(nèi)源基因B2M、外源基因hLF及標記基因EGFP和NptII建立了多重PCR檢測方法,旨在對我國出入境檢驗提供技術支持,為轉(zhuǎn)基因標識制度在轉(zhuǎn)基因動物及其產(chǎn)品中的順利實施提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗所用轉(zhuǎn)人血清白蛋白基因奶?；蚪M來自中國農(nóng)業(yè)大學農(nóng)業(yè)生物技術國家重點實驗室。

1.2 試劑

PCR用Taq DNA聚合酶、dNTPs及緩沖液購自寶生物工程(大連)有限生物有限公司,pGEM-T載體購自Promega公司,瓊脂糖凝膠DNA純化試劑盒、微量質(zhì)粒抽提試劑盒購自OMEGA公司。

1.3 引物

根據(jù)序列號為NM_173893.3的序列設計奶?；蚪M內(nèi)源性基因B2M的引物,根據(jù)序列號為AB049976的序列設計α-LA基因的引物,根據(jù)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因奶牛時構建的載體設計NPTⅡ和EGFP基因的引物。上述引物(表1)均由Beacon Designer 7.0設計,由北京Invitrogen公司合成。

1.4 單一PCR檢測

PCR反應體系為25μ L,其中ddH2O 17.25 μ L,10×PCR buffer(含25 mmol/L MgCl2)2.5 μ L,dNTP(2.5 mmol/L)2 μ L,上下游引物(均為10 pmol/L)各為1 μ L,rTaq DNA聚合酶(5 U/μ L)0.25 μ L,基因組(100 mg/L)1 μ L。PCR反應

表1 多重PCR引物序列T able 1 primer sequences of multiplex PCR

條件:預變性94℃5 min;94℃30 s,58℃30 s,72℃30 s,共30循環(huán);延伸反應72℃7 min。PCR產(chǎn)物用20 g/L瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定后,回收目的片段。將已純化的目的基因片段連接到pGEM-T載體,轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α中,挑取單克隆經(jīng)PCR鑒定后,送北京諾賽基因有限公司測序。

1.5 多重PCR檢測

多重PCR反應體系為25 μ L,其中ddH2O 17.50 μ L,10×PCR buffer(含25 mmol/L MgCl2)2.5 μ L,dNTP(2.5 mmol/L)2 μ L,NPTⅡ、α-LA、EGFP基因上下游引物(均為10 pmol/L)各0.25 μ L;B2M基因上下游引物(均為10 pmol/L)各0.125 μ L,rTaq DNA聚合酶(5 U/μ L)0.25 μ L,基因組1(100 mg/L)μ L。PCR反應條件:預變性94℃5 min,94℃30 s,60℃30 s,72℃30 s,共40循環(huán),延伸反應72℃7 min。PCR產(chǎn)物用20 g/L瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。

2 結果

2.1 單一PCR擴增結果

檢測外源基因α-LA,NPTⅡ和EGFP 2時只有轉(zhuǎn)基因陽性奶牛有條帶擴增,野生型奶牛和空白對照均無條帶擴增,檢測內(nèi)源基因B2M時,轉(zhuǎn)基因陽性奶牛和野生型奶牛均有條帶,空白對照無條帶,與預期結果一致(圖1)。為了保證擴增結果的準確性,4個基因序列都克隆測序,NPTⅡ和EGFP測序結果與生產(chǎn)此轉(zhuǎn)基因奶牛的質(zhì)粒載體序列比對,100%同源;B2M與GenBank中奶牛B2M基因序列100%同源;α-LA測序結果與GenBank中人α-LA基因序列99.8%同源。

圖1 各引物PCR擴增結果Fig.1 PCR products amplified with each primer pairs

2.2 不同退火溫度的多重PCR結果

因為單一PCR擴增時各引物的退火溫度均較寬(數(shù)據(jù)未發(fā)表),選擇55℃～60℃范圍內(nèi)進行多重PCR擴增。隨著溫度的升高4條帶逐漸都得到較好的擴增,以60.5℃擴增效果最好(圖2)。

圖2 溫度梯度多重PCR擴增Fig.2 Multiplex PCR products amplified from gradient annealing temperature

2.3 轉(zhuǎn)基因奶牛多重PCR擴增結果

轉(zhuǎn)基因陽性奶?；蚪M的多重PCR擴增條帶大小與預期一致,3種基因奶?；蚪M均能擴增4條特異性條帶,而野生型奶牛只能擴增內(nèi)源基因B2M,空白對照沒有任何條帶(圖3)。

圖3 多重PCR擴增結果Fig.3 Multiplex PCR amplification

3 討論

多重PCR一個反應即可檢測一個轉(zhuǎn)基因樣品中的多種外源基因結構,盡可能排除假陽性或假陰性,使檢測結果更可靠。也正因為多序列同時擴增,使反應的敏感性受到很多因素的影響,如不同引物對之間的相對濃度、退火溫度、緩沖液濃度、Mg2+濃度等[9]。本研究對引物對相對濃度、退火溫度進行了優(yōu)化,添加相同的引物濃度時,內(nèi)源基因B2M擴增效果最好,其它引物對擴增較弱,而當減少B2M引物對至原來一半時,各個引物對均得到較好擴增;從圖2可以看出隨著溫度的升高,多重PCR擴增效果越來越好。轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測中,如果延長延伸時間,就可能產(chǎn)生過度延伸的產(chǎn)物,從而影響結果的判斷。為了避免產(chǎn)生這種非特異性條帶,PCR延伸時間應適當縮短[10],因考慮到本研究選取的的4對引物相隔較遠(至少2 000 bp),延伸時間適當延長亦不會產(chǎn)生過度延伸的產(chǎn)物,本研究中延伸時間選擇為1 min或30 s時,均能很好的擴增三個條帶,但考慮到節(jié)省時間,所以延伸時間選擇30 s。

轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測時,通過對內(nèi)源基因進行PCR檢測,可以判斷樣品核酸的質(zhì)量,即如果內(nèi)源基因擴增失敗,說明所抽提的核酸中不含該動物的DNA或者所抽提的核酸含有PCR抑制物質(zhì),從而可以避免轉(zhuǎn)基因檢測的假陰性結果,而內(nèi)源基因是單拷貝基因時,能更好的避免假陰性結果。本試驗選擇的內(nèi)源基因B2M是單拷貝基因,不但可以作為多重PCR的內(nèi)源基因,還可以為外源基因定量檢測及拷貝數(shù)的確定提供借鑒。考慮到檢測過程中基因組DNA片段會有不同程度的降解,內(nèi)源基因的擴增片段應選擇較短的目的序列,本研究中內(nèi)源基因B2M擴增長度為121 bp,可有效保證轉(zhuǎn)基因動物及衍生產(chǎn)品的檢測效果。

EGFP和NPTⅡ是制作轉(zhuǎn)基因動物時常用的標記基因,動物自身不攜帶這兩種基因,利用這兩種基因建立的檢測方法可以對轉(zhuǎn)基因動物進行初步篩查。對待檢樣品進行檢測時,如果能同時擴增出兩條特異性條帶,或兩條特異性條帶中任意一條,可以說明待檢樣品是轉(zhuǎn)基因樣品。但是很多轉(zhuǎn)基因動物不含有這兩個原件,因此單靠兩個標記基因?qū)D(zhuǎn)基因動物及其產(chǎn)品進行篩查很容易出現(xiàn)假陰性的結果。而且轉(zhuǎn)基因動物沒有統(tǒng)一啟動子和終止子,不同的表達蛋白往往需要不同的啟動子和終止子。這些因素為轉(zhuǎn)基因動物及產(chǎn)品篩查檢測技術平臺的建立提供了難題。

由于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的安全性評價具有累積性和潛在性特點,并與社會、文化及倫理等多方面因素互為影響,所以需要多方位長期系統(tǒng)的監(jiān)測才能對其安全性作出較為客觀的評價,建立轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測技術平臺尤為重要。本研究建立的多重PCR方法可用于轉(zhuǎn)基因奶牛的檢測,為轉(zhuǎn)基因動物及產(chǎn)品的出入境檢驗及檢測標準的建立提供參考。

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