豬源糞腸球菌和屎腸球菌多重PCR快速鑒定方法的建立*

王亞賓,陳麗穎,胡 慧,段志剛,崔保安

(河南農(nóng)業(yè)大學牧醫(yī)工程學院,河南鄭州450002)

腸球菌為革蘭陽性球菌,是一種重要的條件致病菌[1],存在于肉品中的腸球菌,還是人食物中毒的主要原因[2-3]。近年來,腸球菌對人和動物感染不斷增加,隨著腸球菌耐藥菌株的日益增多,感染后治療也越來越困難,由于不同的腸球菌耐藥性不同,腸球菌種的鑒定就顯得尤為必要[4-5]。感染豬的腸球菌主要是糞腸球菌和屎腸球菌,它們也是醫(yī)院內(nèi)感染和各種環(huán)境介質(zhì)中的優(yōu)勢菌群[6],快速、準確鑒定糞腸球菌和屎腸球菌對于控制腸球菌病具有重要意義。

目前,腸球菌的鑒定主要依靠傳統(tǒng)的生化試驗進行表型鑒定,這需要大量的時間進行生化管的準備和判斷結(jié)果,一些商品化鑒定試劑盒API Rapid ID 32 Srep、BBL Crystal和Vitek-32等,雖能夠快速將腸球菌鑒定到種的水平,檢測結(jié)果也能在24 h后得到有效判讀,但其鑒定的可靠性受到質(zhì)疑[7]。基于PCR方法為腸球菌鑒定提供了可靠的手段,16 S rRNA、熱休克蛋白60(HSP60)、延長因子EF-tu(tuf基因)、ddL和sodA等基因都可分別在種屬水平上鑒定腸球菌,但同時能夠在種屬水平上對感染豬的糞腸球菌和屎腸球菌進行鑒定還沒有報道。筆者利用NCBI公布的16 S rRNA基因序列設(shè)計屬特異性引物,并根據(jù)文獻[8]報道的sodA基因種特異性引物建立同時測定糞腸球菌和屎腸球菌多重PCR方法,以圖為基層實驗室腸球菌病診斷提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種

14株試驗菌株中ATCC29212、CMCC(B)32223糞腸球菌參考菌株由廣東環(huán)凱微生物科技有限公司提供;其余菌株(見表1)均為本室鑒定菌株,其中糞腸球菌(E.faecalis)和屎腸球菌(E.faecium)感染豬的臨床菌株,這些菌株16 S rRNA基因序列均被NCBI收錄。另外53株分離株(L1-L53)選自2006年—2008年期間分離自河南洛陽、濟源、許昌等地送檢病豬的肝、脾、腎豬的臨床感染菌株(30株)、糞便分離菌株(13株)和鄭州市零售鮮豬肉分離株(10株)。2株E.sanguinicola為分離于零售鮮豬肉菌株(Genbank號分別是FJ378700.1和FJ378705.1),鏈球菌(CVCC562)葡萄球菌(ATCC25923)為本室保藏菌株。這些菌株均于50%甘油中在-70℃下由本實驗室保存。試驗時,將其在BHI肉湯中活化,再劃線接種到兔鮮血瓊脂平板上,37℃、24 h培養(yǎng)后使用。

1.2 主要儀器和試劑

3K30型冷凍離心機,sigma公司生產(chǎn);DYY-111-6B型電泳儀,北京六一儀器廠;PTC-200型PCR儀,MJ RESEARCH公司生產(chǎn)。2×PCR TaqMix(北京美萊博醫(yī)學科技有限公司);Protein-ase K(Amresco),瓊脂糖(西班牙進口分裝),DNA Marker寶生物工程(大連)有限公司;酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)(瑞興科技有限公司);腦-心浸萃液態(tài)培養(yǎng)基(BHI)為廣東環(huán)凱微生物科技有限公司產(chǎn)品。其他試劑均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

表1 試驗菌株Table 1 Stains for test

1.3 引物選擇與合成

屬特異性引物參考GenBank公布的腸球菌16 S rRNA基因序列進行設(shè)計,種特異性引物參照文獻[8]報道的糞腸球菌和屎腸球菌引物序列。所有引物由上海博尚生物技術(shù)有限公司合成。引物序列及預(yù)計擴增長度見表2。

1.5 多重PCR方法的建立

1.5.1 模板制備 將腸球菌、葡萄球菌和鏈球菌分別接種于BHI液體培養(yǎng)基,37℃搖床過夜培養(yǎng),收集菌體,按照Messick報道[9]的方法進行常規(guī)酚/氯仿抽提,—20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 PCR擴增 反應(yīng)體系為25 μ L,其中2×PCR TaqMix 8 μ L(0.2 U Taq DNA Polymerase/μ L,400 μ mol/L dNTP each,20 mmol/L pH 8.7 Tris-HCl,100 mmol/L KCl,3 mmol/L MgCl2);正向、反向引物(20 pmol/μ L)各1 μ L;模板DNA 2 μ L。最后補充雙蒸去離子水(9 μ L)至25 μ L。擴增程序如下:95℃預(yù)變性5 min;94℃1 min,47℃45 s,72℃1min,共27個循環(huán);最后于72℃延伸10 min。

1.5.3 PCR特異性試驗 按上述反應(yīng)體系與擴增條件,分別用E.sanguinicola、鏈球菌和葡萄球菌進行陰性對照,用雙蒸水作為空白對照。

1.5.4 PCR敏感性試驗 將提取的CMCC(B)32223和E1株的DNA模板經(jīng)(Thermo)測定含量后,用雙蒸水進行倍比稀釋,設(shè)定含量分別為10 ng、1 ng、100 pg、10 pg、1 pg,按確定的擴增體系和擴增條件進行擴增,以出現(xiàn)特異擴增帶的模板用量的最高稀釋倍數(shù)計算可檢出的腸球菌最低DNA含量。

1.6 臨床分離株的檢測

1.6.1 多重PCR方法檢測 取53株豬的臨床菌株、糞便菌株和鮮豬肉菌株按15 g/L方法進行擴增。取6 μ L PCR擴增產(chǎn)物,經(jīng)含GoldView的15 g/L瓊脂糖凝膠電泳后,進行結(jié)果判定。

1.6.2 16 S rRNA基因測序鑒定 按文獻[10]報道的方法分別對53株分離菌株16 S rRNA進行PCR擴增、克隆,最終的重組菌送北京博尚生物技術(shù)有限公司完成測序,測定的DNA序列以雙鏈堿基互補的結(jié)果為準。并將所測的腸球菌分離株的16 S rRNA基因序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫,與GenBank登陸的細菌的16 S rRNA序列進行BLAST,并同時將測定的腸球菌16 S rRNA基因序列與GenBank已登錄的32種不同種類腸球菌菌株16 S rRNA序列進行同源性分析。

1.6.3 Vitek-32鑒定 取53株分離菌接種到BHI中增菌培養(yǎng)后,再接種到BHIA平板上,經(jīng)24 h培養(yǎng)后挑取典型菌落用0.45%NaCl滅菌鹽水配制成0.6～0.7麥氏單位,利用負壓進樣到革蘭陽性細菌鑒定卡中,并放入Vitek-32全自動細菌鑒定系統(tǒng)的孵化箱中,進行鑒定。

2 結(jié)果

2.1 多重PCR擴增結(jié)果

12株標準株、2株糞腸球菌參考菌株、2株E.sanguinicola、葡萄球菌、鏈球菌以及雙蒸水的PCR擴增結(jié)果見圖1及圖2。由圖1、圖2可見ATCC39212、CMCC(B)32223、E1-E12均有1 096 bp大小的特異性條帶,與預(yù)計的腸球菌屬特異性引物擴增大小片段相同;AT—CC39212、CMCC(B)32223、E4、E5、E7、E8、E10和E12株均有360 bp大小的片段,與設(shè)計的糞腸球菌種特異性引物擴增的大小相當;而E1、E2、E3、E6、E10和E11菌株均有215 bp大小特異性片段,與設(shè)計的屎腸球菌種特異性片段相似。E.sanguinicola也是腸球菌屬的細菌,其也具有腸球菌屬特異性1 096 bp條帶,但在糞腸球菌和屎腸球菌種特異性引物擴增中,則沒有出現(xiàn)相應(yīng)的條帶。鏈球菌和葡萄球菌是非腸球菌屬的細菌,在腸球菌屬和種的引物擴增中,與雙蒸水一樣,均未擴增出相應(yīng)的特異性條帶。

圖1 多重PCR擴增結(jié)果Fig.1 M ultiple PCR results

圖2 多重PCR擴增結(jié)果 Fig.2 Multiple PCR results

2.2 多重PCR敏感性試驗結(jié)果

分別取糞腸球菌和屎腸球菌各1株,提取DNA后用滅菌雙蒸水分別稀釋到含量為10 ng、1 ng、100 pg、10 pg、1 pg,進行敏感性試驗,敏感性試驗結(jié)果見圖3。由圖3可見,CMCC(29223)糞腸球菌在最終濃度為0.1 ng處仍有腸球菌屬和種的特異性條帶;而E1屎腸球菌在最終濃度為1 ng時有屎腸球菌屬和種的特異性條帶,而在濃度為0.1 ng時僅有屎腸球菌屬特異性條帶,沒有種特異性條帶。因此,建立的多重PCR方法對豬源糞腸球菌檢測的敏感性為0.1ng,對屎腸球菌為1 ng。

2.3 臨床分離株檢測結(jié)果

53株分離于豬的臨床菌株、糞便菌株和鮮豬肉菌株全部進行了多重PCR、Vitek-32和16 S rRNA基因測序鑒定,其中,部分菌株多重PCR檢測結(jié)果見圖4。由圖可見,10株分離菌均具有腸球菌屬和種特異性條帶,據(jù)此可以判斷L1-L4、L6、L7、L9、L10屬于糞腸球菌E.faecalis(360 bp);L5、L8屬于E.faecium(215 bp)。通過對53株分離菌的三種鑒定結(jié)果(見表3),發(fā)現(xiàn)多重PCR和16 S rRNA基因測序均能將53株分離菌鑒定到種的水平,而且二者符合率為100%。Vitek-32僅能將53株分離菌中的45株鑒定到種的水平(結(jié)果未報道),另有8株未能鑒定。在鑒定為腸球菌45株中,僅有33株與多重PCR和16SrRNA基因測序鑒定結(jié)果相符合,符合率為62.3%。在3種不同來源的腸球菌中,感染豬的臨床菌株僅有14株與多重PCR和16 S rRNA基因測序鑒定結(jié)果一致,符合率為46.7%,尤其是感染豬的屎腸球菌,18株中僅有4株符合,符合率為22.3%,而對來源于鮮豬肉和糞便中的腸球菌,Vitek-32與多重PCR和16 S rRNA基因測序鑒定結(jié)果符合率較高,分別為80%和84.6%。

圖3 PCR敏感性試驗結(jié)果Fig.3 The results of PCR sensitivity test

圖4 PCR臨床分離株檢測結(jié)果Fig.4 PCR results of the isolated strains

表3 臨床分離株鑒定結(jié)果Table 3 results of identification for isolates

3 討論

目前,腸球菌對人和動物的感染越來越多,耐藥性越來越強,造成的損失也越來越大[11],這就迫切要求對感染的腸球菌進行快速、準確的鑒定。根據(jù)腸球菌16S rRNA基因序列及其他革蘭陽性球菌的比較,設(shè)計腸球菌屬特異性引物,并參考文獻[8]報道的sodA的種特異性引物,通過優(yōu)化反應(yīng)條件,建立了能同時測定糞腸球菌和屎腸球菌的多重PCR方法,具有快速、靈敏、特異性強以及準確特點,為臨床快速鑒定豬腸球菌感染奠定了基礎(chǔ)。

16 S rRNA基因序列已被用作分子鐘(molecular clock)去評估細菌間的相關(guān)性和鑒定未知細菌到屬和種水平[12],多種細菌包括難于培養(yǎng)的細菌均成功用此方法進行了鑒定[13-14]。本研究建立的方法與6 S rRNA基因測序鑒定符合率100%,說明所建立的方法的可靠性;雖然,本方法與Vitek-32的符合率較低,據(jù)報道[15],Vitek-32對非人源腸球菌的鑒定結(jié)果常常受到質(zhì)疑,特別是屎腸球菌。由于屎腸球菌表型差異較大,易已與屎腸球菌群其他細菌發(fā)生混淆[16],這也給生化鑒定方法增加了困難,本次測定的與感染豬的屎腸球菌符合率僅有22.3%,這可能是感染豬的屎腸球菌生化特性變異更大所致。

糞腸球菌和屎腸球菌是人、動物和各種環(huán)境介質(zhì)優(yōu)勢菌群,也是感染豬的主要腸球菌種,本次使用的試驗菌株均是分離于豬的臨床菌株,并經(jīng)過生化實驗、WCPP、16 S rRNA、RAPD及毒力基因鑒定(資料未報),使用的陰性對照菌株葡萄球菌和鏈球菌均是感染豬臨床菌株,臨床上容易與腸球菌感染相混淆,乳球菌由于乳球菌很少引起豬的感染發(fā)病,其他的革蘭陰性細菌可通過染色鏡檢可以區(qū)分,因此,本方法對于鑒定感染豬的糞腸球菌和屎腸球菌具有一定的特異性,有利于基層實驗室對腸球菌病的診斷。

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