基于冰核蛋白的狂犬病毒糖蛋白細菌表面展示*

郭 恒,劉 娟,李慧萍,王學(xué)林,孫樹民,張茂林,高麗芳,徐德啟,2,劉明遠*

(1.人獸共患病研究教育部重點實驗室,吉林大學(xué)人獸共患病研究所,吉林長春130062;2.美國食品與藥品管理局(FDA),美國馬里蘭20892)

狂犬病及其導(dǎo)致的死亡是目前我國最為嚴重的公共衛(wèi)生問題之一。動物狂犬病,尤其是犬狂犬病的流行,是我國人狂犬病發(fā)生的根本原因[1]。接種疫苗是控制動物狂犬病發(fā)生和流行的最有效手段。目前,國產(chǎn)獸用狂犬病疫苗仍以傳統(tǒng)弱毒活疫苗為主,而滅活疫苗又尚未實現(xiàn)國產(chǎn)化,使用成本較高。因此,開發(fā)符合我國國情和狂犬病流行特點的廉價、使用方便、安全性高的新型狂犬病口服疫苗將對從源頭上控制狂犬病在我國的流行產(chǎn)生深遠影響。

冰核蛋白(ice-nucleation protein,INP))是丁香假單胞菌(Pseudomonas syringae)的外膜蛋白,可加速純水的冰晶形成。INP通過糖基磷脂酰肌醇(glucosylphosphatidylinositol,GPI)而錨定在細菌表面,利于大分子蛋白的表面呈現(xiàn)[2]。GPI錨定系統(tǒng)很少發(fā)現(xiàn)于原核生物中,廣泛用于真核表面蛋白如酵母a-凝集素和哺乳動物表面蛋白的錨定。目前使用INP已在大腸埃希菌[2]、沙門菌[3]、鰻弧菌[4]、惡臭假單胞菌[5]、藍細菌[6]等革蘭陰性菌表面成功展示多種蛋白。本試驗擬在大腸埃希菌工程菌中初步驗證我們構(gòu)建的冰核蛋白展示系統(tǒng),為進一步研制基于沙門菌的多抗原表位展示性重組疫苗、新型狂犬病疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、毒株和質(zhì)粒 人用狂犬病毒CTN疫苗株由張茂林博士惠贈,大腸埃希菌(E.coli)JM109、BL21(DE3)、熒光假單胞菌、Vero細胞、pET28a(+)載體由實驗室保存,pMD-18T載體購自TaKaRa公司。

1.1.2 主要試劑 NcoRⅠ、BamHⅠ、XhoⅠ、T4DNA連接酶、DNA凝膠回收試劑盒購自MBI公司,AMV反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑購于Promega公司;Taq DNA聚合酶、DNA標準(DL2000)、中分子質(zhì)量蛋白標準購自寶生物工程(大連)有限公司,Trizol購自Invitrogen公司,鼠源狂犬病毒單抗Rab-50、辣根標記羊抗鼠二抗購自Santa cruz公司,基因組及質(zhì)粒提取試劑盒購自V-gene公司。

1.2 方法

1.2.1 冰核蛋白N末端序列的PCR擴增 以熒光假單胞菌基因組DNA為模板,設(shè)計并合成引物如下:INP1:5′-CGC CAT GGA TCT CGA CAA GGC GT T GGT-3′,INP2:5′-CG GGA TCC AAT CAG ATC ACT GTG GT T GCC-3′(下劃線部分為酶切位點,下同)。PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定后純化回收(具體操作步驟參照DNA凝膠回收試劑盒說明書),連接于pMDl8一T載體構(gòu)建重組質(zhì)粒。PCR和NcoⅠ、BamHⅠ雙酶切質(zhì)粒(質(zhì)粒提取步驟參照質(zhì)粒小提試劑盒說明書)鑒定正確后送北京華大基因研究中心進行序列測定。測序正確的重組質(zhì)粒命名為18T-INP。

1.2.2 狂犬病毒CTN株G蛋白序列的PCR擴增根據(jù)GenBank中收錄的CTN株序列設(shè)計引物如下:CTN-G1:5′-CGG GAT CCA A AT TCC CCA TT T ACA CGA TAC C-3′,CTN-G2:5′-CCC TCG AGT TAC AG C TTG GTC TCA CCT -3′。使用Trizol從感染狂犬病毒CTN-30株的Vero細胞培養(yǎng)液中直接提取總RNA,使用AMV逆轉(zhuǎn)錄酶在42℃60 min下逆轉(zhuǎn)錄合成G基因的cDNA,進而擴增G基因,并按1.2.1方法構(gòu)建重組質(zhì)粒18TRVG。

1.2.3 重組表達載體的構(gòu)建 將質(zhì)粒18T-INP用NcoⅠ和BamHⅠ雙酶切,回收目的片段。該片段與相同酶切的pET28a(+)載體片段16℃在T4 DNA連接酶作用下連接2 h,轉(zhuǎn)化至表達宿主菌BL21(DE3)中。按1.2.1方法進行陽性菌篩選、鑒定等,重組質(zhì)粒命名為pET28a-INP。BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切質(zhì)粒18T-RVG,同法將回收的目的片段插入pET28a(+)和pET28a-INP載體相應(yīng)位點,構(gòu)建重組表達載體pET28a-RVG和pET28a-INPRVG并轉(zhuǎn)入BL21(DE3)菌中。

1.2.4 重組載體的表達 將鑒定正確的重組菌分別按1∶100接種于新鮮的含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中,振蕩培養(yǎng)至吸光度(OD600)為0.4～0.6時,加入IPTG使其終濃度為1 mmol/L,16℃誘導(dǎo)培養(yǎng)12 h,以空載體pET28a轉(zhuǎn)化BL21(DE3)菌為陰性對照。分別收集1 mL菌液離心棄上清,重懸于4×SDS-PAGE上樣緩沖液中,煮沸變性5 min,6 000 r/min離心5 min后120 g/L SDS-PAGE電泳檢測蛋白表達情況。

1.2.7 整體細胞ELISA 將細菌懸浮于PBS中并稀釋至OD600=1.0,包被微量滴定板100 μ L樣品4℃過夜。過多的細胞被去除,200μ L含50g/L BSA的PBS 37℃包被1 h,去除封閉液后,洗3遍,1∶1 000鼠抗RV單克隆抗體Rab-50孵育1 h(37℃)。PBS洗3遍后,1∶10 000辣根標記的羊抗鼠二抗孵育1 h(37℃)。含0.05%Tween-20的PBST洗3遍,TMB solution顯色。2 mol/L H2 SO4終止反應(yīng),450 nm測光吸收度(Bio-Rad,Hercules,CA)。

2 結(jié)果

2.1 基因的克隆

以提取的丁香假單胞菌基因組為模板,擴增出N端截斷的INP cDNA片段。以提取的狂犬病毒CTN株總RNA為模板,RT-PCR擴增出不含信號肽序列的G基因的cDNA片段。10 g/L瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示分別約為600 bp和1 500 bp左右(圖1),與理論值(609 bp和1 518 bp)相符。INP序列測定結(jié)果表明,本研究所克隆的INP基因與華東理工大學(xué)張元興教授克隆的丁香假單胞菌MB03株的冰核蛋白(inaQ)核酸同源性最高,一致性為96%,有5處核苷酸存在差異,并導(dǎo)致兩處氨基酸發(fā)生變化。我們比較了這兩種冰核蛋白展示外源蛋白的效果未見有明顯差異(未發(fā)表)。CTN-G序列測定表明其與GenBank中注冊的序列一致,沒有發(fā)生突變。

圖1 INP和CTN-G基因PCR擴增結(jié)果Fig.1 The amplified results of INP and Rabies virus glycoprotein by PCR

2.2 重組載體的構(gòu)建

將PCR產(chǎn)物與pMD-18T載體連接,PCR和雙酶切鑒定正確后將相應(yīng)的片段插入原核表達載體pET28a(+)中,構(gòu)建重組表達載體pET28a-INPRVG。該載體質(zhì)粒分別以NcoⅠ/BamHⅠ、BamHⅠ/XhoⅠ、NcoⅠ/XhoⅠ進行酶切鑒定,可得到對應(yīng)的約600、1500、2 010 bp的特異切割帶(圖2),與理論值相符。

圖2 pET28a-INP-RVG質(zhì)粒雙酶切鑒定Fig.2 Identification of the recombinant plasmid by double enzyme digestion

2.3 重組載體的表達

pET28a-INP、pET28a-RVG、pET28a-INPRVG重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸埃希菌BL21(DE3)宿主菌中,16℃誘導(dǎo)培養(yǎng)12 h后菌體裂解物經(jīng)SDSPAGE,分別在24、56 ku、77 ku處出現(xiàn)明顯的蛋白表達帶,而pET28a-INP-RVG重組菌還可在56 ku觀測到較弱的蛋白帶,而未誘導(dǎo)及非重組pET28a對照菌均無特異性蛋白帶,與理論相對分子質(zhì)量(24.1、56.6、77.8 ku)相符(圖3)。

圖3 重組質(zhì)粒表達產(chǎn)物的SDS-PAGE檢測Fig.3 SDS-PAGE analysis of the recombinant protein

2.4 蛋白表面展示的初步鑒定

整體細胞ELISA用于對細胞表面展示蛋白情況進行鑒定。含pET28a-INP、pET28a–RVG、pET28a-INP-RV質(zhì)粒的大腸埃希菌誘導(dǎo)表達后直接包被微量滴定板,測得的OD450值分別為0.023 8、038 8和0.165 4(圖4)。相對來說,含pET28a-INPRVG質(zhì)粒的重組菌有更高的吸光度值(分別約是前者的4倍和7倍)。由于使用的是未經(jīng)破碎的誘導(dǎo)后的完整大腸埃希菌進行包被,只有表面展示病毒保護性抗原的重組菌才可被狂犬病毒糖蛋白單抗Rab-50識別,說明我們構(gòu)建的重組蛋白成功展示在細胞表面。

圖4 整體細胞ELISA結(jié)果Fig.4 Whole-cell ELISA of recombinant cells

3 討論

在活細菌表面展示外源蛋白在微生物學(xué)、分子生物學(xué)、免疫學(xué)和生物工藝學(xué)方面有重要的應(yīng)用價值。在細菌表面展示外源抗原利于免疫系統(tǒng)識別抗原,在其它細菌表面成分作用下起到間接免疫佐劑的作用。大多數(shù)展示系統(tǒng)展示的外源抗原大小受限制,同時展示多亞基抗原較難成功。而INP細胞表面展示系統(tǒng)因其展示外源蛋白大、穩(wěn)定、安全、檢測方便等特性近年來引起了更多的關(guān)注。INP含圓柱狀的中央重復(fù)區(qū),其在冰晶的形成過程中起催化作用,而其對膜的錨定是非必須的,因此可用作一個模塊空間來控制外源蛋白和細胞表面之間的長度。當INP表達于細胞表面時,集聚的INP形成糖脂蛋白(glycolipoprotein)復(fù)合物,抵抗蛋白酶降解,保持在靜止期的安全性。表達的INP融合蛋白并未導(dǎo)致膜結(jié)構(gòu)的破壞或宿主生長的障礙,因此INP能在細胞表面過量表達大分子異源蛋白(如90 ku[7])。INP包含3個結(jié)構(gòu)域,即N端獨特區(qū)(CRD),中央重復(fù)區(qū),C端特殊區(qū)。N端由175或179個氨基酸組成,可通過膜-插入信號肽序列錨定到外膜上;圓柱狀的中央?yún)^(qū)由重復(fù)的8-,16-,48-殘基組成,其在冰晶的形成過程中起催化作用;C端由49個aa組成,親水并定位于細胞外。目前,基于INP的細菌表面展示系統(tǒng)有多種構(gòu)建方法,主要取決于外源蛋白融合的部位。雖然融合到C端、N端(保留不同數(shù)目的重復(fù)單元)或二者之間均取得了很好的效果,為盡量降低載體的體積,我們將G蛋白插入到截斷的N端區(qū),同時為避免展示的蛋白間的潛在的立體空間障礙,又保留了兩個重復(fù)亞基(32 aa),初步實驗顯示基于冰核蛋白的細菌表面展示系統(tǒng)構(gòu)建成功。

孟勝利等[8]研究發(fā)現(xiàn)人用狂犬病毒CTN疫苗株與我國分離的街毒株糖蛋白的核酸和氨基酸同源性最高。本實驗提取CTN-30病毒總RNA,RTPCR方法成功克隆到G基因片段,序列分析表明與CTN-1株序列一致,未出現(xiàn)突變?？袢《镜奶堑鞍譍是病毒與宿主細胞結(jié)合的配體,介導(dǎo)了病毒與靶細胞的結(jié)合及在神經(jīng)系統(tǒng)的分布。其不但與病毒的毒力、致病性密切相關(guān),而且是狂犬病毒的主要保護性抗原,能刺激機體產(chǎn)生中和抗體,保護機體抵抗病毒的感染?？袢《镜奶堑鞍譍含有糖基化位點,直接使用原核表達系統(tǒng)用于疫苗的構(gòu)建是不適合的,但展示表位將不存在該問題的困擾。目前G基因的中和線性表位已被插入到犬腺病毒2型載體中[9],顯示了很好的應(yīng)用前景。由于T7表達系統(tǒng)是非常成熟的原核表達系統(tǒng),我們在大腸埃希菌工程菌中對構(gòu)建的表面展示系統(tǒng)進行驗證后,將構(gòu)建一種表面展示狂犬病毒中和線性表位的減毒鼠傷寒沙門菌,并最終將其用于新型狂犬疫苗的運載體。

[1] Hu R L,Fooks A R,Zhang S F,et al.Inferior rabies vaccine quality and low immunization coverage in dogs(Canis familiaris)in China[J].Epidemiol Infect,2008,4:1-8.

[2] Park S W,Gyu M,Lee H Y,et al.Stable ex pression and secretion of polyhydroxybuty rate depolymerase of Paucimonas lemoignei in Escherichia coli[J].The Journal of Microbiology,2008,6(6):662-669.

[3] Yang C,Cai N,Dong M,et al.Surface Display of M PH on Pseudomonas putida JS444 Using Ice Nucleation Protein and Its Application in Detoxi?cation of Organophosphates Surfacedisplayed viral antigens on Salmonella carrier vaccine[J].Biotechnology and Bioengineering,2008,99:30-37.

[4] Xu Y Z,Liu Q,Zhou L Y.Surface Display of GFP by Pseudomonas Syringae truncated Ice nucleation protein in attenuated vibrio anguillarum strain[J].Mar Biotechnol,2008,10:701-708.

[5] Jung H C,Kwon S J,Pan J G.Display of a thermostable lipase on the surface of a solvent-resistant bacterium,Pseudomonas putida GM 730,and its applications in whole-cell biocataly sis[J].BMC Biotechnology,2006,6(23):1-9.

[6] Chungjatupornchai W,Fa-aroonsawat S.Translocation of green fluorescent protein to cyanobacterial periplasm using ice nucleation protein[J].The Journal of Microbiology,2009,47(2):187-192.

[7] Wu M L,Tsai C Y,Chen T H.Cell surface display of Chi92 on Escherichia coli using ice nucleation protein for improved catalytic and antifungal activity[J].Fems Microbiol Lett,2006,256:119-125.

[8] 孟勝利,徐葛林,吳 杰,等.中國12株狂犬病街毒株G基因序列測定與分析[J].中國人獸共患病學(xué)報,2009,25(6):497-501.

[9] 徐慧娟,王曉虎,李 忠,等.狂犬病毒中和線性表位重組犬腺病毒2型載體的構(gòu)建[J].畜牧與獸醫(yī),2008,40(6):1-4.