Ⅱ型單純皰疹病毒糖蛋白D在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)*

姜德玉,劉 坤,趙曉燕,張 偉,李君麗,王希良,于三科*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,陜西楊陵712100;2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所病原微生物生物安全國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京100071)

Ⅱ型單純皰疹病毒(Herpes simplex virus 2,HSV-2)感染可引起生殖器皰疹[1],其發(fā)病率在性病中僅次于淋病和梅毒[2]。如果孕婦感染HSV-2則極易產(chǎn)生流產(chǎn)或造成胎兒先天畸形和智力低下,60%～70%受感染新生兒可因此而死亡,幸存者中95%伴有后遺癥。在美國每年造成的直接經(jīng)濟(jì)損失超過2億美元[3]。此外,HSV-2感染可增加艾滋病和宮頸癌的感染機(jī)率[4]。使用疫苗將是最經(jīng)濟(jì)有效防控HSV-2感染的方法,但目前仍沒有臨床可用的HSV-2疫苗。

HSV-2疫苗主要有全病毒滅活苗、減毒苗、亞單位苗和核酸疫苗等多種形式[5],其中亞單位疫苗研究進(jìn)展最為明顯。G laxo Smithk line疫苗研究組研發(fā)的糖蛋白D-AS04亞單位疫苗具有良好的免疫原性,這種疫苗已經(jīng)在進(jìn)行Ⅲ期臨床擴(kuò)大試驗(yàn),有望成為最先上市的HSV-2疫苗。

糖蛋白是HSV-2的主要免疫原,可誘導(dǎo)細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答,產(chǎn)生高滴度的中和抗激發(fā)遲發(fā)型超敏反應(yīng)和T細(xì)胞增殖。HSV-2的11種糖蛋白中糖蛋白D(glycoprotein D,gD)是宿主體液免疫反應(yīng)的主要靶標(biāo)之一,能誘導(dǎo)產(chǎn)生較高水平的中和抗體,成為亞單位疫苗的首選[5-6]。

本研究基于桿狀病毒表達(dá)體系,將Ⅱ亞單純皰疹病毒優(yōu)勢(shì)靶標(biāo)糖蛋白D轉(zhuǎn)座至穿梭質(zhì)粒,最后形成重組桿狀病毒。再利用真核表達(dá)體系表達(dá)更接近天然構(gòu)象的蛋白,為下一步對(duì)此種亞單位疫苗的評(píng)價(jià)奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒與細(xì)胞 HSV-2 333株(GenBank Z86099)、Vero細(xì)胞、DH 5α感受態(tài)細(xì)胞、DH10Bac感受態(tài)E.coli和Sf9細(xì)胞由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所免疫室保存。

1.1.2 主要試劑 低分子質(zhì)量蛋白Marker、DNA Marker DL 2 000/15 000、MiniBEST V iral RNA/DNA Extraction Kit Ver 3.0試劑盒、各類酶以及pMD18T vector均為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品;pFastBacⅠ質(zhì)粒載體、CellfectinⅡReagent脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒、通用引物均為Invitrogen公司產(chǎn)品;HSV-2 gD antibody(A 33)(sc-80824)為Santa Cruz公司產(chǎn)品;辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗小鼠IgG為北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品。1.1.3 引物 引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司北京合成部合成,共計(jì)4條引物:

P1與P2為gD特異性引物方框內(nèi)分別是EcoRⅠ和XbaⅠ酶切位點(diǎn)。P3與P4為通用性引物。

1.2 方法

1.2.1 全病毒DNA提取及gD基因的擴(kuò)增 生長(zhǎng)良好的單層Vero細(xì)胞上培養(yǎng)HSV-2 333病毒,病毒收獲后取病毒液使用TAKARA公司M iniBEST Viral RNA/DNA Extraction KitVer 3.0試劑盒,參照其提供的說明書提取HSV-2 DNA。取2μL HSV-2 DNA作為模板,用特異性引物P1和P2進(jìn)行RCR反應(yīng):94℃5 min;94℃45 s,55℃45 s,72℃120 s,循環(huán)25次;72℃10m in。命名PCR產(chǎn)物為gD,使用寶生物工程(大連)有限公司的膠回收試劑盒回收純化PCR產(chǎn)物,用10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。

1.2.2 重組質(zhì)粒的獲取及鑒定 將gD連接到pMD18T載體上,轉(zhuǎn)化至DH 5αE.coli,保存于-80℃。用Eco RⅠ和XbaⅠ酶對(duì)gD和桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFastBacⅠ進(jìn)行雙酶切,然后與從pMD18T-gD上雙酶切下的gD進(jìn)行連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH 5α感受態(tài)細(xì)胞中。小量提取質(zhì)粒,利用雙酶切方法鑒定、選取陽性克隆,送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序驗(yàn)證。測(cè)序正確后,提取pFast BacⅠ-gD質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞,pFastBacⅠ-gD質(zhì)粒和DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞中的穿梭質(zhì)粒Bacmid進(jìn)行轉(zhuǎn)座,產(chǎn)生重組穿梭質(zhì)粒Bacmid-gD,挑取陽性轉(zhuǎn)座株堿裂解法提取Bacmid-gD,用特異性引物P1/P2以及通用引物P3/P4進(jìn)行PCR鑒定。

1.2.3 轉(zhuǎn)染及重組桿狀病毒的獲取與鑒定 轉(zhuǎn)染按照Invitrogen公司Bac-to-Bac·Baculovirus Expression System說明書提供的方法進(jìn)行。6孔板每孔鋪8×105個(gè)Sf9細(xì)胞,待細(xì)胞全部貼壁按質(zhì)脂體轉(zhuǎn)染法混合8μLCellfectinⅡReagent與1μg重組DNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞。轉(zhuǎn)染72 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清,用培養(yǎng)上清繼續(xù)感染細(xì)胞,經(jīng)過3代擴(kuò)大培養(yǎng)后,收集培養(yǎng)上清作為重組病毒母液,4℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 重組桿狀病毒TCID50的檢測(cè) 使用半數(shù)組織細(xì)胞感染量方法測(cè)定病毒毒力。測(cè)定方法如下,鋪一定量的Sf9細(xì)胞于96孔板中貼壁,重組桿狀病毒連續(xù)作10倍稀釋從10-1開始同時(shí)設(shè)空白對(duì)照。加入不同稀釋度的病毒感染昆蟲細(xì)胞,27℃作用1 h后,去除含病毒的上清,換上新鮮培養(yǎng)基。27℃培養(yǎng)7 d～10 d,觀察細(xì)胞病變。

1.2.5 重組蛋白的表達(dá) 重組桿狀病毒感染培養(yǎng)的Sf9細(xì)胞,預(yù)設(shè)感染指數(shù)(multiplicity of infection,MOI)為5,細(xì)胞密度為5×105cells/mL,27℃培養(yǎng)72 h,分別收集細(xì)胞培養(yǎng)上清和沉淀,將沉淀用預(yù)冷的PBS洗滌3次,加入細(xì)胞裂解液,30 min內(nèi)迅速反復(fù)凍融3次,于4℃以9 000 r/min離心15m in,將上清收集后于-20℃保存?zhèn)溆谩Ｓ?20 g/L的SDS-PAGE檢測(cè)細(xì)胞裂解后的上清,轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上,電轉(zhuǎn)條件為90 V、90m in,用含50 g/L脫脂奶粉的TBS緩沖鹽溶液(Tris堿3.03 g,NaCl 8.18 g,去離子水定容到1 000mL;pH 7.5)封閉膜2 h。一抗為鼠抗HSV-2單克隆抗體,二抗為1∶6 000倍稀釋的辣根過氧化氫酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG。

2 結(jié)果

2.1 重組桿狀病毒的獲得與鑒定

以HSV-ⅡDNA為模板擴(kuò)增gD基因,10 g/L瓊脂糖凝膠電泳顯示,得到1條約875 bp的目的片段,大小與預(yù)期片段的大小一致,陽性質(zhì)粒測(cè)序鑒定,其結(jié)果與預(yù)期序列完全一致。桿狀病毒重組轉(zhuǎn)移載體pFastBacⅠ-gD雙酶切鑒定結(jié)果見圖1。用通用引物和特異性引物進(jìn)行PCR鑒定重組桿狀病毒穿梭質(zhì)粒,結(jié)果見圖1,表明gD基因已經(jīng)克隆到到桿狀病毒穿梭質(zhì)粒Bacmid中。

圖1 瓊脂糖電泳圖Fig.1 Agarose gelelectrophoresis of PCR products of gD

2.2 重組桿狀病毒轉(zhuǎn)染后細(xì)胞病變觀察

顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染24 h后,細(xì)胞停止擴(kuò)增不再生長(zhǎng)。48 h～72 h后細(xì)胞直徑逐漸變大,細(xì)胞核增大且充滿整個(gè)細(xì)胞,隨著轉(zhuǎn)染時(shí)間延長(zhǎng),細(xì)胞邊緣漸模糊,96 h后細(xì)胞破碎(圖2)。由此可見重組病毒轉(zhuǎn)染成功。

圖2 重組桿狀病毒感染的細(xì)胞病變(200×)Fig.2 CPE of Sf9 cellsafter transfection of recom binant bacm id(200×)

2.3 重組桿狀病毒毒力檢測(cè)

通過觀察昆蟲細(xì)胞病變得到半數(shù)細(xì)胞感染量,再由此半數(shù)細(xì)胞感染量結(jié)果算出重組桿狀病毒毒力為7.5×107pfu/mL(p fu=TCID50×0.69)。

2.4 SDS-PAGE和Western blot檢測(cè)重組蛋白

細(xì)胞感染重組病毒72 h后,收獲細(xì)胞凍融離心得到上清,用120 g/L分離膠進(jìn)行SDS-PAGE,試驗(yàn)組與正常細(xì)胞無明顯差異。Western blot結(jié)果表明,重組病毒表達(dá)蛋白中有特異性條帶出現(xiàn),結(jié)果出現(xiàn)位置35 ku與預(yù)期一致(圖3)。

圖3 表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE及Western blot試驗(yàn)結(jié)果Fig.3 SDS-PAGE and Western blot analysis of products expressed in Sf9 cells

3 討論

桿狀病毒昆蟲表達(dá)系統(tǒng)是表達(dá)外源重組蛋白的主要工具之一,相比于其他表達(dá)系統(tǒng),該系統(tǒng)具有諸多優(yōu)點(diǎn),該表達(dá)系統(tǒng)能夠穩(wěn)定且高水平的表達(dá)外源蛋白[9],其表達(dá)的重組蛋白均具有天然活性。首先,此系統(tǒng)不需要多輪篩選純化重組病毒,顯著縮短了工作周期。其次,昆蟲細(xì)胞要求的培養(yǎng)環(huán)境相對(duì)寬松,一般實(shí)驗(yàn)室都可以滿足昆蟲細(xì)胞生長(zhǎng)條件并適于擴(kuò)大培養(yǎng)。最后,桿狀病毒感染具有很強(qiáng)宿主特異性不會(huì)形成交叉污染。

Ⅱ型單純皰疹病毒尚沒有上市疫苗,主要是此病毒的致病機(jī)制呈現(xiàn)不全,其中包括潛伏機(jī)制和復(fù)發(fā)機(jī)制等,成為疫苗研究的障礙。之前的研究多集中體液免疫反應(yīng),而臨床試驗(yàn)結(jié)果陸續(xù)證明僅提高體液抗體水平不能全面保護(hù)機(jī)體不受感染[7-8]。近期不斷出現(xiàn)關(guān)于細(xì)胞免疫方面的報(bào)道使單純皰疹病毒疫苗研制的成功提供又一保證。研究證明糖蛋白D分子具有多個(gè)中和抗體表位及細(xì)胞免疫反應(yīng)表位[9-12]。

單純皰疹病毒糖蛋白D作為病毒進(jìn)入機(jī)體及介導(dǎo)免疫反應(yīng)的主要靶標(biāo)分子,已在不同的表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)。但大多表達(dá)產(chǎn)物都具有H IS之類的外源標(biāo)簽,這對(duì)后續(xù)疫苗產(chǎn)品的形成帶來了儲(chǔ)多不便。本試驗(yàn)采用Invitrogen公司已經(jīng)商業(yè)化Bac-to-Bac Baculovirus Expression System表達(dá)無標(biāo)簽去除信號(hào)肽部分糖蛋白D,經(jīng)分子水平及蛋白水平的鑒定確有特異性表達(dá)?，F(xiàn)行病毒毒力的測(cè)定多采用空斑試驗(yàn),但由于此種方法操作較復(fù)雜且需時(shí)較長(zhǎng),所以本試驗(yàn)使用半數(shù)組織細(xì)胞感染量的方法,得出病毒毒力。從試驗(yàn)結(jié)果看,重組蛋白經(jīng)各個(gè)條件的摸索及優(yōu)化確有相對(duì)較高的表達(dá),這樣可以后續(xù)試驗(yàn)將繼續(xù)純化重組蛋白并對(duì)其免疫原性進(jìn)行一系列評(píng)價(jià)為進(jìn)一步研制HSV-2重組蛋白疫苗奠定基礎(chǔ)。

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