12種中藥的體外抑菌試驗(yàn)*

黃 玲,林居純,馬 馳,鐘欽卿

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,四川雅安625014)

一直以來,我國(guó)獸醫(yī)臨床主要使用抗菌藥控制細(xì)菌感染。隨著抗生素的廣泛使用,所帶來的毒性反應(yīng)、獸藥殘留及耐藥性等問題日顯突出。針對(duì)抗生素所帶來的問題,獸醫(yī)臨床急需尋找低毒有效的抗菌藥物替代品,以控制疾病的發(fā)生。國(guó)內(nèi)外的研究顯示[1-2],中藥或天然植物提取物,可發(fā)揮對(duì)病原菌直接殺滅作用或提高機(jī)體免疫力達(dá)到防治疾病效果。本試驗(yàn)選用蒲公英等12味中藥,對(duì)大腸埃希菌等3種標(biāo)準(zhǔn)菌,以及30株不同臨床分離菌進(jìn)行了體外抑菌作用研究,旨在篩選出對(duì)臨床耐藥菌株有抑菌作用的藥物,為指導(dǎo)臨床用藥和進(jìn)一步進(jìn)行中藥逆轉(zhuǎn)細(xì)菌耐藥性研究提供基礎(chǔ)工作。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 中藥 蒲公英、五倍子、烏梅、黃連、黃芩、金銀花、大黃、秦皮、穿心蓮、白頭翁及苦參,購(gòu)自四川省雅安市惠民堂藥店;木耳購(gòu)自雅安市蒼坪山農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。

1.1.2 供試菌株 標(biāo)準(zhǔn)菌株:金黃色葡萄球菌ATCC25923,大腸埃希菌ATCC25922,沙門菌C79-13;臨床分離菌株:金黃色葡萄球菌(耐磺胺類藥物)10株(SA 1～SA 10)、大腸埃希菌(耐阿莫西林和耐四環(huán)素)10株(E1～E10)、沙門菌(耐喹諾酮類藥物)10株(S1～S10),由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)藥學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存提供。

1.1.3 儀器與試劑 超凈工作臺(tái)(蘇凈集團(tuán)安泰公司);SPX型生化培養(yǎng)箱(寧波東南儀器有限公司);微量移液器(德國(guó)Eppendorf公司);營(yíng)養(yǎng)瓊脂、MH瓊脂、MH肉湯購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 藥液的制備 稱取潔凈干燥藥材剪碎后置于燒杯中,加蒸餾水沒過藥材1 cm左右,浸泡20 min后加10倍于藥材量的水,置于電爐加熱,煮沸30 min后用紗布過濾,再加5倍于藥量的水沒過濾渣,煮沸30m in后過濾,將兩次濾液合并濃縮至1 g/mL,流通蒸汽滅菌20 min,放入4℃冰箱備用。

1.2.2 菌液的制備 將大腸埃希菌ATCC25922等3株標(biāo)準(zhǔn)菌和30株臨床分離菌在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上畫線培養(yǎng)后,挑取單個(gè)菌落接種于MH肉湯中培養(yǎng)12 h～16 h,作為原菌液。

1.2.3 MH平板的制備 將滅菌后的MH瓊脂培養(yǎng)基傾注至無菌平皿,待培養(yǎng)基冷卻后形成厚度為4mm的平板。制成的MH平板取出一個(gè)置37℃溫箱培養(yǎng)24 h做無菌試驗(yàn),其余用密封袋封好置4℃冰箱保存,7 d內(nèi)用完[3]。

1.2.4 抑菌試驗(yàn) 采用管碟法。用無菌棉簽蘸取濃度為105cfu/mL～106cfu/mL的細(xì)菌稀釋液,涂布于MH平板上,用無菌鑷子將鋼管均勻擺放平板上,靜置10 m in～15m in,滴加中藥藥液,加至液面與鋼管表面平行即可[4]。將平板37℃培養(yǎng)12 h～18 h后,用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈大小。

1.2.5 試驗(yàn)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) 試驗(yàn)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn):抑菌圈直徑大于20 mm為高度敏感,10 mm～19mm為中度敏感,小于10 mm為不敏感[5]。

2 結(jié)果

2.1 12種中藥對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌株的抑菌效果

12種中藥中木耳、穿心蓮、白頭翁、苦參對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌株無抑菌作用;其余8種中藥對(duì)3種標(biāo)準(zhǔn)菌株表現(xiàn)出不同程度的抑菌效果(表1)。

2.2 12種中藥對(duì)臨床菌株的抑菌效果

12種中藥中除木耳、穿心蓮、白頭翁、苦參對(duì)臨床分離菌株無抑菌作用外,其余藥物均有抑菌作用。其中五倍子、烏梅對(duì)不同種類的30株臨床菌株均表現(xiàn)出高度敏感;黃連,蒲公英分別對(duì)金黃色葡萄球菌和沙門菌表現(xiàn)出高度敏感;其余藥表現(xiàn)為中度敏感(表2)。

表1 不同中藥對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌株抑菌效果Table 1 Bacteriostatic effect of different Chinese herbalm edicines on standard bacteria

表2 不同中藥對(duì)不同臨床菌株抑菌效果Table 2 Bacteriostatic effect of different Chinese herbal medicines on different isolates

3 討論

體外抑菌試驗(yàn)方法有二倍稀釋法、紙片法、管碟法、打孔法等。有研究表明二倍稀釋法操作繁瑣,且藥液顏色不易觀測(cè)。打孔法因中藥液黏稠度大,以至滴在孔內(nèi)的藥液難以擴(kuò)散,故以上兩種方法都有局限性。管碟法和紙片法技術(shù)上雖簡(jiǎn)單易行,但紙片所吸附的藥量不好確定,且吸附到紙片上的藥液又不易擴(kuò)散,故影響藥物的抑菌效果[6]。而管碟法取量精確,試驗(yàn)結(jié)果較為準(zhǔn)確且有規(guī)律,故本試驗(yàn)采用此方法進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),木耳、穿心蓮、白頭翁、苦參4味藥對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌和臨床分離菌均無抑菌活性。木耳現(xiàn)多研究其對(duì)免疫功能的影響[7],而無抑菌作用的報(bào)道,本試驗(yàn)選取木耳依據(jù)是其熬制的湯久置不腐敗。關(guān)于穿心蓮[8-9]、白頭翁[10-11]、苦參[12-13]抑菌活性的報(bào)道不一,本試驗(yàn)中穿心蓮、白頭翁、苦參均無抑菌活性,其原因有待進(jìn)一步研究。另外,試驗(yàn)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)不同也可能是抑菌效果不一致的原因,因此筆者認(rèn)為應(yīng)盡快為中藥抑菌試驗(yàn)結(jié)果確定統(tǒng)一的判定標(biāo)準(zhǔn)。

由試驗(yàn)結(jié)果可知,蒲公英等8味中藥對(duì)3種細(xì)菌均有一定的抑制作用,其中蒲公英、五倍子、烏梅、黃連、金銀花抑菌活性較強(qiáng)。本試驗(yàn)中蒲公英、金銀花1 g/mL的水煎劑對(duì)細(xì)菌均有抑制作用,與其他報(bào)道基本一致[9,14]。五倍子中抑菌成分多認(rèn)為是鞣質(zhì),但有研究表明提除鞣質(zhì)后仍有抑菌作用[8],其具體抑菌機(jī)理有待研究。烏梅酸性極強(qiáng),其抑菌作用是否與酸性有關(guān),還有待研究。對(duì)黃連的殺菌作用研究得較成熟[15],其機(jī)理主要是抑制微生物糖代謝。

本次試驗(yàn)結(jié)果顯示8味中藥對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌和臨床分離菌均有抑制作用,雖然抑菌圈大小有一定差異,但經(jīng)t檢驗(yàn)差異無顯著性(P＞0.05),提示8味中藥均有很好的應(yīng)用前景,故可進(jìn)一步開展消除細(xì)菌耐藥性的研究。另外,鑒于中藥同時(shí)作用于細(xì)菌和動(dòng)物機(jī)體以發(fā)揮療效,可以進(jìn)行8種中藥的體內(nèi)抑菌活性研究,以便更好地指導(dǎo)臨床用藥。

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