均勻設(shè)計(jì)法優(yōu)選中藥免疫復(fù)方的試驗(yàn)

張 明

(菏澤學(xué)院生命科學(xué)系,山東菏澤274015)

多糖作為免疫活性成分對(duì)免疫功能的調(diào)節(jié)作用已經(jīng)得到了證實(shí)[1-3],中藥單方提取大多數(shù)都是以某一成分為指標(biāo),然后去研究其化學(xué)成分及其機(jī)理,而機(jī)體是一個(gè)多靶點(diǎn)、多層次、非線性的免疫系統(tǒng),僅僅單方成分無(wú)法達(dá)到整體的免疫效果,隨著中藥現(xiàn)代化進(jìn)程的加快,中藥免疫復(fù)方的研究越來(lái)越受到重視[4-6]。本試驗(yàn)采用索式提取器連續(xù)回流提取法[7],應(yīng)用免疫學(xué)原理和均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)相結(jié)合,以免疫器官指數(shù)(a)、巨噬細(xì)胞吞噬活性(b)和淋巴細(xì)胞增殖率(c)三項(xiàng)加權(quán)作為綜合指標(biāo)(t=0.2a+0.4b+0.4c),從器官、細(xì)胞水平上研究復(fù)方中草藥多糖與免疫功能之間的相關(guān)性及回歸關(guān)系,從而優(yōu)選出最佳免疫復(fù)方,以其為中草藥免疫增強(qiáng)劑以及保健酒、保健飲料的配方開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥材 黃芪、枸杞、人參和當(dāng)歸購(gòu)于菏澤牡丹藥店中藥科。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康昆明小鼠120只,體重18 g～22 g,購(gòu)于菏澤醫(yī)學(xué)?？茖W(xué)校動(dòng)物飼養(yǎng)中心。

1.1.3 儀器 DG-3022型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀為國(guó)營(yíng)華東電子管廠產(chǎn)品;CO2培養(yǎng)箱為美國(guó)Reveo公司產(chǎn)品;75-2A型微量振蕩器為上海醫(yī)用分析儀器廠產(chǎn)品;恒溫培養(yǎng)箱為天津市津北真空儀器廠產(chǎn)品;倒置顯微鏡及照相系統(tǒng)(O lym pus IX-50)為重慶光學(xué)儀器產(chǎn)品;721紫外分光光度計(jì)為上海第二儀器廠產(chǎn)品;96孔細(xì)胞培養(yǎng)板為德國(guó)Nunclon公司產(chǎn)品;RPM I1640培養(yǎng)液為Gibco公司產(chǎn)品;四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)為Amresco公司產(chǎn)品;易得小鼠淋巴細(xì)胞分離液為達(dá)科為生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品;二甲基亞砜(DMSO),分析純,為Amresco公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)中藥復(fù)方配伍原則,選取4種免疫效果好的中草藥通過DPS統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)4個(gè)因素6水平進(jìn)行均勻設(shè)計(jì)優(yōu)選,優(yōu)選方案見表1。

表1 因素與水平Table 1 Factors and levels

1.2.2 水溶醇提法 取黃芪、人參、枸杞和當(dāng)歸粗粉按表1比例,置索式提取器圓底燒瓶中,按液固比為20∶1、提取溫度為100℃、提取時(shí)間170 min,醇沉淀濃度比85%,回流提取,提取2次,濾過,合并濾液,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮,冰箱中放置24 h,最后2 000 r/min離心15 min,反復(fù)洗滌2次,最后真空干燥箱烘干,采用硫酸-苯酚法測(cè)其含量和得率[8]。

1.2.3 中藥復(fù)方對(duì)小鼠免疫功能的影響

1.2.3.1 試驗(yàn)分組與動(dòng)物處理 將120只(雌雄各半)試驗(yàn)小鼠,按照均勻設(shè)計(jì)隨機(jī)分為6組,每組20只;小鼠禁食12 h后,試驗(yàn)用6組中藥復(fù)方提取的多糖經(jīng)計(jì)算按2 mg/kg藥量每日灌胃0.5mL,連續(xù)7 d,于最后1次灌胃24 h后,每組隨機(jī)取10只用于免疫器官指數(shù)觀察,5只用于巨噬細(xì)胞吞噬活性的觀察,另外5只無(wú)菌取脾,制成單個(gè)脾細(xì)胞懸液,用于測(cè)定脾淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)。

1.2.3.2 小鼠脾免疫器官指數(shù)的觀察 每組取10只小鼠解剖后無(wú)菌取脾,電子天平稱量脾重量和小鼠重量,計(jì)算免疫器官指數(shù)(免疫器官指數(shù)等于脾重量除以小鼠的重量)。

1.2.3.3 小鼠巨噬細(xì)胞吞噬活性的測(cè)定 取上述每組5只小鼠,按常規(guī)方法無(wú)菌收集腹腔巨噬細(xì)胞,經(jīng)2 000 r/min離心,洗滌后,將收獲的細(xì)胞懸浮于RPM I1640培養(yǎng)液中,分別調(diào)整細(xì)胞的濃度為1×106個(gè)/mL,接種于30 mm直徑的培養(yǎng)皿中,置37℃中培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h后,棄上清液,用培養(yǎng)液充分洗滌培養(yǎng)皿3次以上,去除非貼壁細(xì)胞,臺(tái)盼蘭排斥法檢測(cè)細(xì)胞存活率大于95%,取細(xì)胞懸液5mL于6mm直徑的培養(yǎng)皿中,依次加入辣根過氧化物酶緩沖液100μL,37℃培養(yǎng)箱中15 min,分光光度計(jì)600 nm檢測(cè)OD值[9](測(cè)OD值等于加藥處理的OD值減去對(duì)照的OD值,然后除以對(duì)照的OD值)。

1.2.3.4 脾淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn) 取上述5只小鼠頸椎脫臼處死,無(wú)菌取脾臟,用滅菌生理鹽水沖洗3次,加入5 mL易得淋巴細(xì)胞分離液,放入上面裝有100目網(wǎng)孔的尼龍網(wǎng)袋中,用針桶擠壓過濾收集細(xì)胞液,2 000 r/m in離心20 min,吸取中間云霧狀白細(xì)胞層,用Hank＇s液洗2次。用RPM I1640營(yíng)養(yǎng)液稀釋成1×106/mL的細(xì)胞懸液,分別向96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加細(xì)胞,每孔100μL,重復(fù)4孔。另設(shè)無(wú)細(xì)胞調(diào)零孔。將細(xì)胞培養(yǎng)板放入體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)44 h,每孔中加入20μL MTT液,繼續(xù)培養(yǎng)4 h取出,各孔吸出上清液,加入DMOS 100μL,在微量震蕩器上混勻使其顏色變澄清,用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀570 nm下的吸光度作為淋巴細(xì)胞增殖的指標(biāo)(測(cè)OD值等于加藥處理的OD值減去對(duì)照的OD值,然后除以對(duì)照的OD值)。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 采用DPS9.50數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行設(shè)計(jì),運(yùn)用多因子及互作項(xiàng)逐步回歸統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行分析[10]。

2 結(jié)果

2.1 各免疫指標(biāo)的試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果見表2。1、2、3、4、4、5、6組的免疫器官指數(shù)分別為0.69%、0.80%、0.74%、0.84%、0.62%、0.76%;吞噬活性分別為24.14%、25.33%、25.22%、26.38%、24.89%、24.17%;淋巴增殖率分別為18.11%、19.34%、18.88%、19.64%、19.11%、18.67%。

2.2 中藥免疫復(fù)方對(duì)免疫器官指數(shù)的影響

通過DPS統(tǒng)計(jì)軟件,進(jìn)行多因子及互作項(xiàng)逐步回歸,結(jié)果見表3。由表3可知,除X2和X2×X3與Y之間負(fù)相關(guān)外,其它各單方及互作項(xiàng)間均達(dá)到正相關(guān),而X1、X1×X3和X 1×X 4與Y之間分別達(dá)到0.93、0.71和0.80?；貧w模型優(yōu)化方程為Y=0.634 7+0.006 4X1,統(tǒng)計(jì)量值F=25.48,p=0.003 8,相關(guān)系數(shù)R=0.92,表明方程擬合度良好,中藥復(fù)方與免疫器官差異顯著,最高指標(biāo)時(shí)組合:X1=30;X2=11.64;X3=9.76;X4=15.76;Y=0.83。

表2 均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)與結(jié)果Table 2 Uniform design resu lts

表3 中藥各單方及互相作用因素與免疫器官指數(shù)的相關(guān)性Table 3 The relativity of single drug prescription or interaction factors and immune organ indexes

2.3 中藥免疫復(fù)方對(duì)吞噬活性的影響

通過DPS統(tǒng)計(jì)軟件,進(jìn)行多因子及互作項(xiàng)逐步回歸,結(jié)果見表4,由表4可知,X 2、X1×X 2 X2×X3、X 2×X4與Y之間負(fù)相關(guān)外,其它各單方及互作項(xiàng)間均達(dá)到正相關(guān)。由表5可知,X2直接通經(jīng)系數(shù)是-1.30,而X 1×X 3、X1×X4、X 2×X4的間接通經(jīng)系數(shù)分別為0.11、0.04、0.50;X 1×X3、X2×X4的直接通經(jīng)系數(shù)分別為0.75和0.65,而X 2對(duì)其間接通經(jīng)系數(shù)分別為-0.19和-1.00?；貧w模型優(yōu)選方程Y=25.709 7-0.124 1X 2+0.001 6X1×X3-0.000 5X1×X4+0.002 1X 2×X 4,統(tǒng)計(jì)量值F=4 464.39,p=0.01,相關(guān)系數(shù)R=0.91,表明方程擬合度良好,中藥復(fù)方與巨噬細(xì)胞吞噬活性之間差異顯著,最高指標(biāo)時(shí)組合:X1=30;X 2=4;X3=36;X4=6;Y=26.85。

2.4 中藥免疫復(fù)方對(duì)淋巴細(xì)胞增殖率的影響

通過DPS統(tǒng)計(jì)軟件,進(jìn)行多因子及互作項(xiàng)逐步回歸,結(jié)果見表6,由表6可知,除X2和X2×X3與Y之間負(fù)相關(guān)外,其它各單方及互作均達(dá)到正相關(guān),而X1、X1×X4與Y之間分別達(dá)到0.8、0.84?；貧w模型優(yōu)化方程為Y=17.999 7+0.003 4X1×X 4,統(tǒng)計(jì)量值F=9.68,P=0.03,相關(guān)系數(shù)R=0.80,表明方程擬合度良好,中藥復(fù)方與淋巴細(xì)胞增殖率之間顯著。最高指標(biāo)時(shí)組合X1=30;X2=5.83;X3=15.63;X4=36;Y=21.71。

表4 中藥各單方及互相作用因素與吞噬活性的相關(guān)性Table 4 The relativity of single drug prescription or interaction factors and phagotrophy activity

表5 各單方及互相作用項(xiàng)的通經(jīng)系數(shù)Table 5 The path coefficient of single drug prescription or interaction factors

表6 中草藥各單方及互相作用因素與淋巴細(xì)胞增殖率的相關(guān)性Table 6 The relativity of single drug prescription or interaction factor and lymphopoiesis rate

2.5 中藥免疫復(fù)方對(duì)免疫綜合指標(biāo)的影響

通過DPS統(tǒng)計(jì)軟件,進(jìn)行多因子及互作項(xiàng)逐步回歸,結(jié)果見表7,由表7可知,除X2和X1×X2、X2×X3、X2×X4與Y之間負(fù)相關(guān)外,其它各單方及互作均達(dá)到正相關(guān),由表8可知,X2、X1×X3、X2×X4直接通經(jīng)系數(shù)分別為-1.05、0.71、0.39,但綜合分析三者相關(guān)系數(shù)分別為-0.64、0.60、-0.30,回歸模型優(yōu)化方程為Y=18.1190-0.076 1X2+0.001 1X1×X3+0.000 9X2×X4,統(tǒng)計(jì)量值F值=31.43,P=0.03,相關(guān)系數(shù)R=0.97,表明方程擬合度良好,中藥復(fù)方與免疫綜合指標(biāo)差異顯著。最高指標(biāo)時(shí)組合X1=30;X2=4;X3=36;X4=36;Y=19.10。

表7 中草藥各單方及互相作用因素與免疫綜合指標(biāo)的相關(guān)及顯著性Table 7 The relativity of single drug prescription or interaction factors and overall evaluation indexes

表8 各單方及互相作用項(xiàng)的通經(jīng)系數(shù)表Table 8 The path coefficient of single drug prescription or in teraction factors

2.6 驗(yàn)證試驗(yàn)

取4種中草藥粗粉,按X1=30;X 2=4;X 3=36;X 4=36配方提取復(fù)方分別測(cè)免疫器官指數(shù)、吞噬活性和淋巴細(xì)胞增殖率及綜合指標(biāo),結(jié)果分別為0.83、26.30、19.15和18.72,此驗(yàn)證結(jié)果與均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)預(yù)測(cè)結(jié)果基本接近。

3 討論

均勻設(shè)計(jì)法是一種多因素多水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法,該方法通過各因素及互作項(xiàng)與測(cè)定指標(biāo)之間建立回歸模型,找出各因素及互作項(xiàng)的測(cè)定指標(biāo)的相關(guān)性及顯著性,再通過通經(jīng)系數(shù)進(jìn)一步尋找該配方中各因素及互作項(xiàng)對(duì)其的影響,最終優(yōu)選出適宜的中草藥免疫復(fù)方。

中藥成分比較復(fù)雜,而生物體是一個(gè)多位點(diǎn)、多靶點(diǎn)復(fù)雜的體系,如果想單一把某種活性成分提取出來(lái),然后再組合起來(lái)驗(yàn)證其功效,事倍功半,而中藥之所以能治療一些疑難雜癥,可能是其中的某一個(gè)主要成分或者幾個(gè)成分相互協(xié)調(diào)共同作用的結(jié)果,因此,單方提取純化再組合就可能失去了某種有效成分,達(dá)不到其真正的療效,而復(fù)方提取基本保持了原有的有效成分?？赡茉趶?fù)方中,不僅各單藥之間存在顯著相關(guān)性,而且兩兩中藥間存在互作效應(yīng),而且差異顯著,本試驗(yàn)中黃芪和人參表現(xiàn)為協(xié)同效應(yīng),并且二者差異顯著,而枸杞和當(dāng)歸也表現(xiàn)為促進(jìn)作用,但差異不顯著。通過免疫綜合指標(biāo)來(lái)代替免疫器官指數(shù)、吞噬活性和淋巴細(xì)胞增殖率3個(gè)單個(gè)免疫指標(biāo),從而建立一個(gè)全面的免疫復(fù)方篩選方法,本試驗(yàn)最優(yōu)免疫復(fù)方組合為黃芪30 g,枸杞4 g,人參36 g,當(dāng)歸36 g,復(fù)方多糖含量49.15%,多糖得率為8.66%。

致謝:2006級(jí)生物科學(xué)班李苗苗、盧惠同學(xué)和朱道玉主任對(duì)該研究給予了支持和幫助,特此感謝。

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