莢膜組織胞漿菌和馬爾尼菲青霉菌鑒定分析

張淑瓊 董云華 劉海云 李明

(1.昆明市盤龍區(qū)人民醫(yī)院檢驗科 云南昆明 650011; 2.云南省第一人民醫(yī)院檢驗科 云南昆明 650021)

莢膜組織胞漿菌（Histoplasma capsulatum,H.cap)和馬爾尼菲青霉菌(Penicillium marneffei,P.mar)都是溫度依賴型的雙相真菌，由于兩種真菌引起的疾病臨床表現(xiàn)和病理表現(xiàn)非常相似，常引起誤診和誤報。因此，對于在組織中（一般為血液、骨髓〕出現(xiàn)酵母疑為此二者時。不僅在形態(tài)上應(yīng)進(jìn)行認(rèn)真甄別，而且還應(yīng)進(jìn)行病原的培養(yǎng)做確認(rèn)鑒定。我們從血液科2例患者的骨髓中培養(yǎng)出莢膜組織胞漿菌和馬爾尼菲青霉菌各1例，現(xiàn)報道如下。

病人基本情況。組織胞漿菌病患者:男，36歲，云南羅平縣工人。持續(xù)發(fā)熱、消瘦2月余，鞏膜及皮膚黃疸。腹脹20余天。自2001年5月起出現(xiàn)無明顯原因的發(fā)熱，以夜間及清晨為重。就診前在當(dāng)?shù)啬翅t(yī)院診斷為“傷寒”并進(jìn)行對診治療無效且癥狀加重。入院前門診檢查B超提示肝脾腫大、腹水。第一肝門區(qū)胰頭周圍多個淋巴結(jié)腫大。腹壁靜脈顯露。全腹壓痛、反跳痛。下肢浮腫。淺表淋巴結(jié)無腫大。WBC7.9×109/L,PLT20×109/L,Hb100g/L。金標(biāo)法抗-HIV檢測陰性。CD4:37.6%，CD8:31.2%?？?HEV IgM陽性。經(jīng)確診后用伊曲康唑抗真菌及其它對應(yīng)治療有所改善轉(zhuǎn)院。于2002年2月，到省一院復(fù)診為正常，體重增加20多斤。主訴及其它身體情況良好。

馬爾尼菲青霉菌病患者:男，40歲，云南廣南縣干部，發(fā)熱、頭痛一月多。體重減輕，到省一院就診前有牙齦出血史。曾在某醫(yī)院診斷為“肺結(jié)核”并抗癆治療無效。入院肝脾輕度腫大，右頸前淋巴結(jié)腫大如黃豆，有壓痛，邊界清，活動好。皮膚可見散在瘀斑、瘀點，以四肢為甚。B超提示肝脾腫大,未見腹水。WBC4.4×109/L,PLT54 ×109/L,Hb130g/L。金標(biāo)法抗-HIV檢測陽性。CD4:1.43%，CD 8: 49.3%。經(jīng)確診后用氟康唑抗真菌治療明顯改善出院。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本來源 此2例病人均為省一院血液科住院患者。涂片物及培養(yǎng)物均取自患者骨髓。

1.1.2 培養(yǎng)基 沙保羅培養(yǎng)基(SDA I)，根據(jù)配方自制;雙相培養(yǎng)瓶(MLI)為進(jìn)口成品,購自生物·梅里埃公司;血瓊脂采用進(jìn)口哥輪比亞瓊脂（Columbia agar)加5%綿羊血配置;尿素酶培養(yǎng)基為國產(chǎn)柯氏尿素瓊脂，按常規(guī)配置后分裝為斜面。小培養(yǎng)后染色用乳酸棉蘭液（LPCB）染色鏡檢。

1.2 方法

1.2.1 骨髓涂片 穿刺取骨髓少許，涂片、固定、瑞氏染色，顯微鏡下觀察。

1.2.2 真菌培養(yǎng) 取骨髓組織少許分別接種于MLI培養(yǎng)基內(nèi)，在35℃中培養(yǎng)，待其生長后再移種于SDAI、哥輪比亞血瓊脂各2份，分別置于25℃和35℃2種溫度環(huán)境孵育，一定時間觀察菌落形態(tài)及鏡下菌體形態(tài)特點。組織胞漿菌取雙相培養(yǎng)基瓊脂面菌落作尿素酶實驗。馬爾尼菲青霉菌直接取雙相培養(yǎng)基瓊脂面菌落在SDA上進(jìn)行小培養(yǎng)觀察帚狀枝結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果

2.1 骨髓涂片（×1000）:按常規(guī)瑞氏染色

組織胞漿菌:鏡下可見巨噬細(xì)胞內(nèi)大小基本一致的圓形或卵圓形孢子，直徑約2～4μm，孢子內(nèi) 胞漿多呈半月形并集中于孢子一端，孢子邊緣有未染色區(qū)域似莢膜(實為細(xì)胞壁在染色過程中皺縮所致)。孢子一端稍尖，另一端稍圓，大多聚集成群，充滿胞漿，可有的孢子位于細(xì)胞外(圖1)。

馬爾尼菲青霉菌:鏡下可見巨噬細(xì)胞內(nèi)圓形或卵圓形孢子，但大小不一致，直徑從1～8μm不等，可見到蠟?zāi)c樣孢子;也可見到中間有橫壁的孢子和分裂相孢子（裂殖方式繁殖，一分為二）。此有橫壁的孢子或分裂相孢子具有極大的診斷價值(圖2)。

2.2 真菌培養(yǎng)特征

組織胞漿菌:種入雙相培養(yǎng)瓶35℃培養(yǎng)。第8天在瓊脂面及液體呈良好生長。無溶血，培養(yǎng)液中有灰白色、大小不等細(xì)顆粒。多數(shù)沉于底部，部分懸浮在培養(yǎng)液體中，少數(shù)浮于液面。瓊脂上長有約0.2～0.8mm的大小不等灰白色邊緣不齊菌落。搖動液體不能洗落菌苔，難挑取。涂片見菌絲及孢子。革蘭染色見到厚壁孢子（圖5）轉(zhuǎn)出到哥輪比亞血瓊脂35℃培養(yǎng)培養(yǎng)呈酵母相，10d左右呈褐色、表面有皺折酵母樣菌落。涂片為圓或近圓酵母孢子。將此血平板又置25℃培養(yǎng)又返回呈菌絲相，培養(yǎng)10d左右，菌落呈現(xiàn)白色，菌落表面羊毛絨狀（圖3）。同時轉(zhuǎn)入SDAI平板一份，25℃培養(yǎng)20d左右。取菌落涂片則可看見芽生孢子、厚壁孢子，甚至齒輪狀大分生孢子（圖6）。

馬爾尼菲青霉菌:種入雙相培養(yǎng)瓶35℃培養(yǎng)。第5天明顯渾濁，第7d在瓊脂面及液體呈良好生長。培養(yǎng)液中呈均一的絮狀沉淀生長，可見到其間連接有微紅色、細(xì)小、表面“刺”樣小突起的顆粒。瓊脂上長有大小不均、微紅色、扁平、表面有絲的菌落。搖動液體不能洗落菌苔，難挑取。涂片可見大量菌絲及少量孢子。轉(zhuǎn)出一份到哥輪比亞血瓊脂放35℃培養(yǎng)，轉(zhuǎn)出二份用SDA25℃做小培養(yǎng)和平板培養(yǎng)，10d左右觀察。35℃血瓊脂培養(yǎng)呈酵母相，菌落大小不一，呈桔紅色，表面呈凸起腦回狀，周圍有一圈扁平毛狀緣,培養(yǎng)基中無色素擴散。涂片見酵母孢子，以長、端鈍圓的孢子為主，大小不一?？梢姷揭欢舜?，另一斷稍小的“蠟?zāi)c”孢子。偶爾可見大角度二分枝，各端鈍圓的孢子。25℃平板為菌絲相。培養(yǎng)菌落呈淺黃色,隨著培養(yǎng)時間增加,可呈邊緣黃色,菌落中心黃綠色，表面呈凸起腦回狀。在幾乎無色的SDA上產(chǎn)生水溶性的玫瑰紅色素（圖4）。小培養(yǎng)十天染色鏡檢找到典型的雙輪生青霉帚狀枝，產(chǎn)生帚狀枝的菌絲較其它產(chǎn)生帚狀枝的菌絲為粗。可見到2個和3個?；鞴；?～6個瓶梗。分生孢子橢圓形，有明顯孢間連體（圖7）。

3 尿素酶試驗

將HC接種到尿素酶培養(yǎng)基中，25℃條件下5d開始出現(xiàn)弱陽性反應(yīng)。

4 討論

4.1 播散型的組織胞漿菌和馬爾尼菲青霉菌的感染均出現(xiàn)在系統(tǒng)免疫力降低的患者

侵犯網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)，累及多器官。骨髓（或血液）組織中的表現(xiàn)均為巨噬細(xì)胞中含一些酵母，使用恰當(dāng)?shù)娜旧椒ǎㄈ鏕MS、Wright stain），結(jié)合臨床表現(xiàn)，在組織（特別是骨髓和血液）中對其酵母染色的形態(tài)、結(jié)構(gòu)進(jìn)行仔細(xì)觀察也能作出正確的鑒別。因此，骨髓或血液涂片染色鏡檢對組織胞漿菌和馬爾尼菲青霉菌感染的病原診斷具有重大意義。

4.2 此二者均為雙相型真菌，即35℃酵母相，25℃菌絲相

但我們在培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn):在35℃條件下用生物·梅里埃的雙相血培養(yǎng)瓶，兩者都在第7、8天左右呈現(xiàn)程度不同的酵母、菌絲混合相。將此真菌轉(zhuǎn)入在固體瓊脂平板35℃條件培養(yǎng)，12d左右生長良好。涂片則為很純的酵母。與馮國琴等報道一致。也說明了真菌的“相”不僅與溫度有關(guān)，而且也與培養(yǎng)基的營養(yǎng)條件和形態(tài)密切相關(guān)。營養(yǎng)條件較好的液體培養(yǎng)基更有利真菌的生長繁殖和典型的形態(tài)出現(xiàn)。

4.3 組織胞漿菌病呈全球性散在分布，以南美為主

可經(jīng)鳥類、蝙蝠、雞、動物等傳播。大多感染呈隱匿型感染，極少數(shù)表現(xiàn)為類似結(jié)核或肺炎的癥狀。而播散型則侵犯全身網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)，常見肝脾及淋巴結(jié)腫大，預(yù)后不佳。馬爾尼菲青霉菌病分布在東南亞地區(qū)（包括老撾、越南印度尼西亞、中國香港），以泰國北部的青邁（Chiang Mai）地區(qū)為主，中國廣西地區(qū)有區(qū)域性的流行。感染者大多數(shù)為AIDS患者。被感染者一般引起患者皮膚結(jié)節(jié)、膿腫及周圍淋巴結(jié)腫大。播散型與組織胞漿菌病癥狀類似，預(yù)后較差。云南地處亞熱帶，動植物豐富，與泰國相鄰，與老撾、越南及廣西省接壤;日益發(fā)展的旅游業(yè)和有一定數(shù)量的AIDS患者。這些都給組織胞漿菌和馬爾尼菲青霉菌的感染、致病提供了非常有利的條件。在云南近年也有零星報道，但都由于缺乏對細(xì)胞內(nèi)感染孢子形態(tài)、特點的詳盡描述和進(jìn)一步培養(yǎng)或特異性強的免疫組化鑒別、驗證，而有所爭議。所以，對此二菌感染所致疾病的病原學(xué)診斷，不但對臨床診治具有很大的價值，而且對組織胞漿菌病和馬爾尼菲青霉菌病的流行病學(xué)研究也有重要意義。

（組織胞漿菌的鑒定得到國際人畜真菌學(xué)會副主席Glenn S.Buimer教授的幫助，特此致謝?。?/p>

[1]王家俊.臨床真菌檢驗[M].上海:上海醫(yī)科大學(xué)出版社，1995: 195～198.

[2]Glenn S.Buimer.Fungus Diseases in the Orient.(THIRD EDITION) 1995.Published & Distributed by REX Book Store.1995,P66～70;173～175.

圖1 HC骨髓細(xì)胞內(nèi)形態(tài)（Wright's,× 1000)

圖2 P.mar骨髓細(xì)胞內(nèi)形態(tài)（Wright's,× 1000)

圖3 HC血平板形態(tài)（RT）

圖4 P.mar SDAI平板形態(tài)（RT)

圖5 HC 厚壁孢子（Gram's,×1000)

圖6 HC小培養(yǎng)齒輪狀分生孢子（RT×400)

圖7 P.mar 小培養(yǎng)帚狀枝及小分生孢子（RT×400)