次氯酸介導(dǎo)的氧化應(yīng)激及其病理生理學(xué)意義

李婷婷，彭 軍

(中南大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)系，湖南長沙 410078)

活性氧(reactive oxygen species，ROS)是具有高反應(yīng)活性的一類含氧自由基或分子的總稱，主要包括超氧陰離子、羥自由基、過氧化氫(H2O2)、氫過氧化物和次氯酸(hypochlorous acid，HClO)等。生理條件下，細胞內(nèi)ROS的水平被控制在很低的范圍，在抗菌、抑制炎癥反應(yīng)和抑制腫瘤等方面具有積極意義，且對氧化還原信號傳導(dǎo)通路中敏感的蛋白激酶具有調(diào)節(jié)作用。但在疾病狀態(tài)或機體遭受某些損害性刺激時，ROS的生成迅速加快并在體內(nèi)蓄積，引起氧化應(yīng)激損傷。

HClO是ROS中的一種強氧化劑，主要由活化的中性粒細胞和巨噬細胞產(chǎn)生，具有很強的殺菌作用，殺菌能力約為H2O2的50倍。基礎(chǔ)水平的HClO對于機體抵御外來病原體的入侵具有積極意義，但HClO水平過高時則會誘導(dǎo)氧化應(yīng)激對機體造成損傷。越來越多的研究表明，HClO在動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)、高血壓、心力衰竭和糖尿病等許多疾病病理變化中起著重要作用［1－2］。

1 次氯酸的來源及生物學(xué)特性

早期研究認為，機體內(nèi)的HClO主要由中性粒細胞和單核巨噬細胞中的髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)催化生成。MPO主要功能之一為催化H2O2與氯化鐵反應(yīng)生成HClO。新近在人和鼠的血管內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞中檢測到一種含有血紅素成分、對過氧化物酶抑制劑高度敏感的酶，它也能催化H2O2生成HClO，命名為血管過氧化物酶(vascular peroxidase，VPO)。VPO至少包括 VPO1和 VPO2亞型，前者在人和鼠的心臟、血管內(nèi)皮細胞及平滑肌細胞中均中均高表達，而后者只在人的心臟中表達，與前者有63%的同源性［3］。VPO可能是心血管系統(tǒng)中產(chǎn)生ROS的主要催化酶之一。

HClO是一種中性小分子，可以自由通過細胞膜，也很容易接近病菌，其氧化性極強，性質(zhì)高度活潑，在機體抵御病原微生物等入侵中發(fā)揮著重要作用。HClO能直接滲入到細菌和病毒體內(nèi)，與其蛋白質(zhì)、核酸和酶等發(fā)生氧化反應(yīng)，從而殺死病原微生物。體內(nèi)的HClO部分以次氯酸鹽的形式存在，次氯酸鹽一方面促進細胞內(nèi)溶酶體、吞噬體的融合，增強其殺傷吞噬微生物的功能;另一方面，次氯酸鹽可滅活組織和血液中的蛋白酶抑制因子如α1-抗胰蛋白酶(α1-antitypsin)，使中性粒細胞釋放溶解性蛋白酶，以降解外來蛋白。MPO的抗菌(包括抗細菌、真菌和病毒)活性可能繼發(fā)于HClO的作用［4］。由于HClO具有很強的氧化特性，當(dāng)病理情況下HClO的生成過量時，則會引起氧化應(yīng)激，對組織細胞造成損害，參與AS、細胞凋亡和衰老等多種病理生理過程。

2 次氯酸與動脈粥樣硬化

HClO介導(dǎo)的氧化應(yīng)激通過炎癥反應(yīng)參與AS的形成已被廣泛報道，但由于HClO的不穩(wěn)定性不易被檢測，可用MPO的水平間接反映HOCl水平。研究表明，AS斑塊中存在MPO表達，急性心肌梗死和不穩(wěn)定型心絞痛患者MPO水平顯著高于正常人群及穩(wěn)定型心絞痛患者，提示MPO可作為一種預(yù)測急性冠狀動脈綜合征的生物標(biāo)志分子［1］。此外，用HClO孵育大鼠頸總動脈可誘導(dǎo)內(nèi)膜和中膜細胞凋亡，隨后出現(xiàn)血管增殖性反應(yīng)，導(dǎo)致新生內(nèi)膜中異質(zhì)細胞群形成，這與粥樣斑塊形成中出現(xiàn)的血管損傷非常相似。新近研究表明，HClO可通過損傷血管內(nèi)皮功能、氧化修飾脂蛋白和增加斑塊的不穩(wěn)定性等多條途徑促進AS形成［5－6］。

2.1 次氯酸與血管壁損傷

動脈內(nèi)皮細胞受損及其功能障礙是AS的始動環(huán)節(jié)，①HClO可通過多條途徑促進血管內(nèi)皮細胞損傷，延緩其修復(fù):HClO能抑制金屬蛋白酶組織抑制因子1的活性，從而激活動脈壁基質(zhì)裂解蛋白，使基質(zhì)蛋白聚糖降解，減少細胞外基質(zhì)與內(nèi)皮細胞的黏附，促進內(nèi)皮細胞受損、脫落，啟動粥樣硬化病變;②HClO的氧化產(chǎn)物之一，3-氯酪氨酸通過增加超氧陰離子生成和活化胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(ERK1/2)途徑促進人主動脈平滑肌細胞遷移［7］，從而加速 AS的發(fā)展;③HClO誘導(dǎo)生成的高級氧化蛋白產(chǎn)物(advanced oxidative protein products，AOPP)通過激活p38 MAPK途徑上調(diào)單核細胞趨化因子1的表達，促進單核細胞趨化活化，導(dǎo)致受損血管壁炎癥細胞浸潤［8］。

2.2 次氯酸與脂質(zhì)氧化

低密度脂蛋白(low-density lipoprotein，LDL)是肝臟合成的內(nèi)源性膽固醇及膽固醇轉(zhuǎn)運到周圍組織的主要形式，在AS早期被巨噬細胞吞噬，形成泡沫細胞沉積于血管內(nèi)膜下，促進AS的發(fā)生發(fā)展。然而，巨噬細胞幾乎不能吞噬原形LDL形成泡沫細胞。LDL必須經(jīng)過氧化修飾變成氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL)才能成為巨噬細胞的吞噬對象。LDL可誘導(dǎo)過氧化物酶的活性，增加HClO產(chǎn)量，HClO作用于LDL酪氨酸殘基產(chǎn)生酪酰基自由基，進而誘發(fā)LDL氧化的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，產(chǎn)生ox-LDL。研究證實，能生成HClO的內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞和巨噬細胞均能產(chǎn)生ox-LDL。ox-LDL可以通過促進中性粒細胞黏附和細胞因子如集落刺激因子、血管平滑肌生長因子和單核細胞化學(xué)趨化因子等表達損傷動脈內(nèi)膜，導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙［4－5］。

HClO除了氧化LDL，還能氧化修飾抗粥樣硬化的高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)，HDL通過將膽固醇從巨噬細胞中移出和抗LDL氧化來延緩AS。HClO氧化破壞HDL的盤狀結(jié)構(gòu)組裝［5］，并加快其結(jié)構(gòu)的重建和融合，對血清中球形結(jié)構(gòu)的HDL也有類似的破壞作用，大大減弱了HDL抗粥樣硬化能力。HDL可分為多個亞類，但各亞類均呈現(xiàn)出類似的HClO內(nèi)在氧化易感性［9］。HClO還可影響其膽固醇的逆向轉(zhuǎn)運作用。研究發(fā)現(xiàn)，HClO能使載脂蛋白A-Ⅰ發(fā)生氧化修飾，降低了其促進膽固醇的逆向轉(zhuǎn)運作用［10］。

2.3 次氯酸與粥樣斑塊破裂

HClO可降解細胞外基質(zhì)，使纖維帽變薄，同時激活金屬蛋白酶，增加斑塊表面的不穩(wěn)定性，使斑塊易于破裂。HClO促進斑塊破裂的機制復(fù)雜多樣，如通過基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)調(diào)節(jié)纖維帽厚度:AS發(fā)展到后期，隨著脂肪斑的增大，組織可分泌MMP來分解脂肪斑頂層的組織，使其內(nèi)容物釋出，HClO破壞MMP-7的前驅(qū)物，分解其半胱氨酸中硫與鋅的結(jié)合鍵，使酶活性區(qū)域暴露，加速脂肪斑周圍組織的破壞及消化。HClO也通過誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞凋亡引起內(nèi)皮脫落，導(dǎo)致斑塊糜爛并使斑塊易損性增加，促進冠脈綜合征的發(fā)生［6］。此外，亞致死濃度的HClO可誘導(dǎo)內(nèi)皮組織因子的表達，促進血栓形成［11］。

2.4 次氯酸與血管新生內(nèi)膜形成

新生內(nèi)膜的形成是血管內(nèi)膜炎癥反應(yīng)后出現(xiàn)的血管異常增生，在AS中普遍存在。新生內(nèi)膜中最主要的細胞成分為平滑肌細胞，而這些平滑肌細胞在表型和基因表達方面都不同于中膜的平滑肌細胞，其表型為合成型，分泌和表達細胞外基質(zhì)、趨化因子和有絲分裂原蛋白，參與血管重塑。體外研究發(fā)現(xiàn)，HClO可引起血管內(nèi)膜和中膜細胞凋亡以及凋亡后反應(yīng)性異常增生形成新生內(nèi)膜，明顯降低血管彈性［7］。用HClO處理過的血管無論組織學(xué)還是功能特性與AS斑塊都十分相似。

3 次氯酸與細胞凋亡

HClO 20 ～50 μmol·L－1可迅速誘導(dǎo)細胞凋亡，表現(xiàn)出一系列典型的凋亡標(biāo)志，包括膜聯(lián)蛋白V標(biāo)記、胱天蛋白酶活化、染色質(zhì)濃縮和細胞體積縮小等［12］。HClO的清除劑牛磺酸可有效阻止血管內(nèi)皮細胞的凋亡。有趣的是，HClO氧化來源的ox-LDL可通過線粒體途徑誘導(dǎo)外周血單核細胞和U937單核細胞凋亡，但無法誘導(dǎo)單核源性巨噬細胞凋亡［13］，其機制尚不明確。HOC1誘導(dǎo)細胞凋亡可能涉及 Bcl-2，Bax，JNK，p-JNK，P53，F(xiàn)as和胱天蛋白酶的活化等，例如HClO誘導(dǎo)的膽管上皮細胞凋亡即濃度依賴性增加胱天蛋白酶3活性及P53和p-JNK的表達［14］。

線粒體氧化應(yīng)激在細胞凋亡中起著不可替代的作用，HClO對線粒體的氧化損傷很可能是其促凋亡的一個重要途徑，新近開發(fā)的線粒體抗氧化劑MitoQ和SS31可顯著抑制細胞凋亡［15］。

3.1 次氯酸對線粒體滲透性轉(zhuǎn)運孔的影響

線粒體通透性轉(zhuǎn)運孔(mitochondrial permeability transition pore，MPTP)是線粒體內(nèi)外信息交流的中心樞紐，它的開放是細胞凋亡的早期事件。HClO誘導(dǎo)線粒體功能障礙和細胞凋亡依賴于其誘導(dǎo)線粒體通透性轉(zhuǎn)運功能的變化。HClO主要通過氧化MPTP上的氧化還原敏感位點如二硫鍵部位引起線粒體腫脹和崩解以及膜電位改變，從而誘導(dǎo)MPTP通透性改變，此過程伴有細胞色素c的釋放。

Bcl-2家族對凋亡的控制可通過調(diào)控MPTP的關(guān)閉和開放來實現(xiàn)的。研究顯示，Bcl-2蛋白可能是HClO的直接或間接靶點。HClO可迅速下調(diào)內(nèi)皮細胞中Bcl-2的表達、促進Bcl-2蛋白降解，其具體機制有待進一步研究。Bcl-2可通過增加胞內(nèi)的還原性物質(zhì)如谷胱甘肽(glutathione，GSH)，升高煙酰胺腺嘌呤二核苷酸/還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的比值，促進GSH進入核內(nèi)而影響細胞的氧化還原狀態(tài)。應(yīng)用HClO后，細胞內(nèi)GSH水平迅速降低，可能與HClO降解Bcl-2蛋白相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，HClO誘導(dǎo)人間質(zhì)祖細胞的凋亡時，HClO可迅速誘導(dǎo)Bax蛋白構(gòu)象發(fā)生變化，線粒體膜通透性改變，導(dǎo)致細胞凋亡［16］。

3.2 次氯酸與凋亡信號分子

HClO能誘導(dǎo)胱天蛋白酶活化，促進細胞凋亡［17］。多聚ADP-核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase，PARP)是一種重要的DNA修復(fù)酶，在細胞凋亡早期的監(jiān)測和修復(fù)中起了關(guān)鍵作用。PARP是胱天蛋白酶家族(如胱天蛋白酶3和胱天蛋白酶7)的作用底物，后者可使PARP的DNA修復(fù)功能喪失。采用免疫印跡分析方法的研究表明，HClO可增強內(nèi)皮細胞胱天蛋白酶3的活性，加速PARP的降解，從而促進細胞凋亡。

鈣離子作為第二信使在細胞凋亡信號傳導(dǎo)中起著重要作用。HClO能濃度依賴性地激活肌漿網(wǎng)鈣離子釋放通道，導(dǎo)致快速鈣釋放。HClO的神經(jīng)毒性與細胞內(nèi)鈣離子濃度的增加密切相關(guān)，鈣通道拮抗劑和鈣離子螯合劑能阻止α-胞襯蛋白裂解和細胞凋亡［18］。鈣蛋白酶是一種降解蛋白質(zhì)的酶，主要作用是降解肌肉中各種蛋白質(zhì)，其活性受肌細胞中鈣離子的濃度影響，鈣離子可以激活此蛋白。鈣蛋白酶激活后可以使收縮蛋白部分降解，肌絲反應(yīng)性降低，引起肌細胞收縮功能抑制。研究發(fā)現(xiàn)，HClO可通過激活鈣蛋白酶和誘導(dǎo)溶酶體破裂，促進皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡。

4 次氯酸與細胞衰老

細胞衰老是指組成細胞的物質(zhì)在運動中不斷受到內(nèi)外環(huán)境的影響而發(fā)生損傷，造成功能退行性下降而老化，是新陳代謝的自然現(xiàn)象。細胞衰老時會出現(xiàn)DNA復(fù)制與轉(zhuǎn)錄受抑制、蛋白質(zhì)含量下降、酶活性降低和代謝速率變慢等一系列變化。研究發(fā)現(xiàn)，HClO 1 ～10 μmol·L－1可加速年輕細胞的衰老，而HClO 0.1 ～1 mmol·L－1可直接引起細胞膜溶解，導(dǎo)致細胞死亡。而年老細胞對低濃度HClO敏感，HClO 1 μmol·L－1即可引起卵母細胞死亡［19］。

HClO能抑制促進細胞生長發(fā)育的某些重要蛋白質(zhì)表達。蛋白質(zhì)表達的過程涉及基因轉(zhuǎn)錄、mRNA出核轉(zhuǎn)運及以mRNA為模板的蛋白質(zhì)翻譯等環(huán)節(jié)，位于核被膜的核苷三磷酸酶是細胞核mRNA出核轉(zhuǎn)運的主要限速酶。ATP或GTP作底物時，HClO 1 nmol·L－1～5 μmol·L－1濃度依賴地抑制肝細胞核核苷三磷酸酶活性，抑制蛋白質(zhì)表達［8］。

含巰基的蛋白質(zhì)在許多重要代謝反應(yīng)中起關(guān)鍵作用，也參與衰老相關(guān)信號傳導(dǎo)系統(tǒng)。巰基是HClO主要作用靶點之一，HClO對巰基的氧化修飾通常造成其不可逆損傷。GSH等抗氧化劑可減輕HClO誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)損傷。GSH含量的降低可能在衰老機制中起了重要作用，在缺乏GSH情況下，無論整體、細胞還是提取的蛋白質(zhì)受HClO的損害都要嚴(yán)重得多［20］。

此外，HClO可引起骨骼肌肌漿網(wǎng)損傷，HClO呈濃度依賴性抑制肌漿網(wǎng)中Ca2+-ATP酶活性，某些抗氧化劑如銀杏葉提取物761等可保護Ca2+-ATP酶免受HClO的氧化修飾，其機制可能為阻止HClO對巰基的破壞，抗氧化劑和Ca2+-ATP酶保護劑可對HClO所致衰老作用提供雙重保護［21］。

5 結(jié)語

綜上所述，病理條件下HClO可通過多條途徑對組織細胞造成損傷。一方面HClO本身是強氧化劑，可對機體多種生物大分子物質(zhì)如蛋白質(zhì)、核酸和脂肪等直接造成氧化損傷;另一方面，HClO還可能作為一種信號分子參加了細胞凋亡和衰老等多條信號傳導(dǎo)途徑。闡明HClO在這些信號途徑中的作用和機制，可能為許多疾病的防治提供新的作用靶點。維持基礎(chǔ)水平的HClO對機體是必要和有益的，闡明HClO代謝調(diào)節(jié)機制，防止HClO的過度聚積，則可預(yù)防和緩解HClO對組織細胞造成的損傷。

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