用于篩選組蛋白去乙?；敢种苿┘?xì)胞模型的驗(yàn)證

杜芝燕，王 妍，徐元基，于曉?shī)l

(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所病理生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，北京 100850)

組蛋白是構(gòu)成人體染色質(zhì)基本成分 核小體的重要組成部分，由DNA雙鏈纏繞組蛋白異八聚體構(gòu)成核小體。研究表明，在組蛋白的賴氨酸尾部存在著多種修飾，包括磷酸化、甲基化、乙?；胺核鼗龋@些修飾對(duì)于基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)具有重要的調(diào)控作用［1］。已知細(xì)胞內(nèi)存在的2種酶類參與了組蛋白乙酰化的調(diào)節(jié)，即可以增強(qiáng)乙酰化的組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶及可以抑制乙?；慕M蛋白去乙?；?histone deacetylase，HDAC)。在正常情況下，這2種酶活性之間的動(dòng)態(tài)平衡保證了組蛋白的乙?；腿ヒ阴；癄顟B(tài)的調(diào)節(jié)。當(dāng)組蛋白呈高乙?；癄顟B(tài)時(shí)，核小體的空間構(gòu)象較為開(kāi)放，利于各種轉(zhuǎn)錄因子接近DNA，促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄。而組蛋白的去乙?；瘎t使DNA與組蛋白之間呈緊密結(jié)合狀態(tài)，不利于基因轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致一些基因的表達(dá)關(guān)閉［2］。目前的研究表明，腫瘤組織中組蛋白呈去乙酰化狀態(tài)，這種狀態(tài)介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄抑制，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。而采用HDAC抑制劑增強(qiáng)組蛋白的乙酰化，則可以活化相應(yīng)基因的表達(dá)，抑制腫瘤增殖，阻斷細(xì)胞周期，促進(jìn)細(xì)胞分化或凋亡［3］。已經(jīng)證實(shí)，HDAC抑制劑在多種腫瘤細(xì)胞系及動(dòng)物移植瘤模型中均具有良好的腫瘤殺傷和抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的活性，且對(duì)正常細(xì)胞毒性較低，這種高效低毒的作用特點(diǎn)使其成為頗為理想的抗腫瘤新藥［4］。目前數(shù)種HDAC抑制劑，如縮酯環(huán)肽(depsipeptide)FK228、N-辛二酰苯胺異羥肟酸(suberoylanilide hydroxamic acid，SAHA)和 MS275等在美國(guó)已經(jīng)進(jìn)入Ⅱ期臨床試驗(yàn)。該類化合物種類較多，大多由植物及微生物代謝物中提取，從已有的單體化合物庫(kù)或已知中草藥有效成分中尋找新型HDAC抑制劑需要快速的篩選體系。本研究旨在驗(yàn)證由本實(shí)驗(yàn)室建立的藥物篩選細(xì)胞模型［5］的可靠性及適用性。

1 材料與方法

1.1 藥物和試劑

FK228和曲古抑菌素A(trichostatin A，TSA)由美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院癌癥研究所David SCHRUMP博士提供，SAHA由英國(guó)阿斯利康(AstraZeneca)公司提供?？鼓[瘤藥5-氮雜-2'-去氧胞苷(5-aza-2'-deoxycytidine，DAC)、紫杉醇(paclitaxel)、維 A 酸(tretinoin)、姜黃素(curcumin)、槲皮素(quercetin)、白藜蘆醇(resveratrol)、大黃素(emodin)、芹菜素(apigenin)、染料木素(genistein)等分別購(gòu)自Sigma公司;LipofectamineTM2000陽(yáng)離子脂質(zhì)體購(gòu)自Invitrogen公司;熒光素酶檢測(cè)試劑盒(Luciferase Assay System)購(gòu)自Promega公司;TD20/20光度計(jì)由美國(guó)Turner Designs公司生產(chǎn);非洲綠猴腎成纖維細(xì)胞COS-7細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型的制備

前期工作發(fā)現(xiàn)了2種可以被HDAC抑制劑特異性活化的啟動(dòng)子序列，通過(guò)采用分子克隆的方法構(gòu)建了含有該啟動(dòng)子序列及熒光素酶報(bào)道基因的真核表達(dá)載體，將其命名為pTA1及pTA2［5］。將COS-7細(xì)胞按1×105接種于24孔培養(yǎng)板，將擴(kuò)增純化的pTA1和pTA2載體以脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞，經(jīng)G418 1 g·L－1加壓篩選21 d后，獲得2種穩(wěn)定表達(dá)外源基因的細(xì)胞抗性克隆。將該抗性細(xì)胞分別命名為COS-pTA1及COS-pTA2細(xì)胞，并作為細(xì)胞模型用于后續(xù)藥物篩選。

1.3 細(xì)胞處理及熒光素酶活性測(cè)定

分別取2種轉(zhuǎn)染細(xì)胞5×104接種24孔板，次日將細(xì)胞分為藥物處理和二甲亞砜(DMSO)對(duì)照組，每組設(shè)2個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞經(jīng)藥物處理特定時(shí)間后，按照熒光素檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行細(xì)胞裂解，采用單管法用TD20/20光度計(jì)進(jìn)行酶活性測(cè)定。藥物活性以相對(duì)熒光素酶單位(relative luciferase unit，RLU)表示，RLU=藥物處理組熒光素酶活性/對(duì)照組熒光素酶活性，對(duì)照組相對(duì)熒光素酶活性為1。RLU＞1說(shuō)明具有活化作用。

1.3.1 組蛋白去乙酰化酶抑制劑影響COS-pTA1細(xì)胞誘導(dǎo)熒光素酶表達(dá)的時(shí)間效應(yīng)

將 COS-pTA1 細(xì)胞分別用FK228 46.2 nmol·L－1，SAHA 5 μmol·L－1和 TSA 300 μmol·L－1作用 1，3，6，12和24 h，檢測(cè)熒光素酶活性。

1.3.2 組蛋白去乙?；敢种苿┯绊慍OS-pTA1細(xì)胞誘導(dǎo)熒光素酶表達(dá)的濃度反應(yīng)

COS-pTA1 細(xì)胞分別用 FK228 0，23.1，46.2，92.4 和 184.8 nmol·L－1;SAHA 0，2.5，5，10 和 20 μmol·L－1;TSA 0，150，300，600 和 900 μmol·L－1處理24 h，檢測(cè)熒光素酶活性。

1.3.3 模型細(xì)胞熒光素酶活化的敏感性檢測(cè)

2 種模型細(xì)胞分別用 FK228 0，23.1，46.2，92.4和 184.8 nmol·L－1;TSA 0，150，300，600 和 900 μmol·L－1處理24 h，檢測(cè)熒光素酶活性。

1.3.4 模型細(xì)胞熒光素酶活化的特異性檢測(cè)

依據(jù)臨床常用有效劑量確定 FK228 92.51 nmol·L－1，DAC 5 μmol·L－1，維A 酸5 μmol·L－1和紫杉醇5 nmol·L－1與模型細(xì)胞作用24 h，檢測(cè)熒光素酶活性。

1.4 采用具有抗腫瘤活性藥物驗(yàn)證細(xì)胞模型

將獲得的2種轉(zhuǎn)染模型細(xì)胞以5×104密度接種于24孔培養(yǎng)板，次日采用6種已知具有抗腫瘤活性中藥提取物分別處理細(xì)胞24 h:姜黃素20 μmol·L－1，大黃素 50 μmol·L－1，槲皮素 100 μmol·L－1，染料木素 20 μmol·L－1，芹菜素 370 μmol·L－1及白藜蘆醇20 μmol·L－1，檢測(cè)熒光素酶活性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 FK228，SAHA和TSA對(duì)TA1啟動(dòng)子元件活化的時(shí)間效應(yīng)

圖1結(jié)果顯示，F(xiàn)K228，SAHA和TSA在3，6，12和24 h熒光素酶活性與0 h相比均明顯升高(P＜0.01)，而處理1 h與0 h相比無(wú)顯著差異。用藥24 h后，誘導(dǎo)的熒光素酶活性相對(duì)較高，因此，后續(xù)藥物篩選實(shí)驗(yàn)處理時(shí)間定為24 h。

圖1FK228，N-辛二酰苯胺異羥肟酸(SAHA)和曲古抑菌素A(TSA)對(duì)轉(zhuǎn)染含有組蛋白去乙酰化酶(HDAC)啟動(dòng)子序列及熒光素酶報(bào)道基因表達(dá)載體(pTA)1的COS-7細(xì)胞(COS-pTA1)熒光素酶活性的時(shí)間效應(yīng)影響.RLU:相對(duì)熒光素酶單位.RLU=藥物處理組熒光素酶活性/對(duì)照組熒光素酶活性，對(duì)照組相對(duì)熒光素酶活性為1.±s，n=4.＊＊P＜0.01，與0 h組比較.Fig.1 Time-dependent effect of FK228，suberoylanilide hydroxamie acid(SAHA)and trichostatin A(TSA)on luciferase activity in COS-pTA1 cells.

2.2 FK228，SAHA和TSA對(duì)TA1啟動(dòng)子元件活化的濃度效應(yīng)

圖2結(jié)果顯示，F(xiàn)K228，SAHA和TSA可以呈濃度依賴性地增強(qiáng)COS-pTA1細(xì)胞熒光素酶活性，用藥后熒光素酶活性增強(qiáng)3～12倍，其最低有效濃度分別是 FK228 23.1 nmol·L－1，SAHA 2.5 μmol·L－1及 TSA 150 μmol·L－1，這些濃度均低于藥物殺傷細(xì)胞的濃度，顯示該細(xì)胞模型對(duì)HDAC抑制劑的反應(yīng)具有高敏感性及濃度依賴性，F(xiàn)K228相關(guān)系數(shù)為0.7236，SAHA相關(guān)系數(shù)為0.7997，TSA 相關(guān)系數(shù)為 0.9815(P ＜0.01)。

圖2 FK228，SAHA和TSA對(duì)TA1啟動(dòng)子元件活化的濃度效應(yīng).細(xì)胞分別用3種藥物的4個(gè)濃度處理24 h，對(duì)應(yīng)濃度1～濃度4 的具體藥物濃度為 FK228 23.1，46.2，92.4 和 184.8 nmol·L－1;SAHA 2.5，5，10 和 20 μmol·L －1;TSA 150，300，600 和 900 μmol·L －1.±s，n=3.＊＊P＜0.01，與對(duì)照組比較.Fig.2 Concentration-effect of FK228，SAHA and TSA on TA1 promotor activiation.

2.3 FK228和TSA對(duì)TA1和TA2啟動(dòng)子活化敏感性的影響

圖3 FK228和TSA對(duì)TA1和TA2啟動(dòng)子活化敏感性的影響.兩種模型細(xì)胞分別用FK228和TSA處理24 h.±s，n=3.＊＊P ＜0.01，與 COS-pTA2細(xì)胞模型組比.Fig.3 Effect of FK228 and TSA on activation sensitivity of TA1 and TA2 promotors.

圖3結(jié)果表明，F(xiàn)K228及TSA對(duì)COS-pTA1細(xì)胞的熒光素酶激活活性均高于COS-pTA2細(xì)胞，在較高的藥物濃度下，其活化程度相差近1倍(P＜0.01)。提示2種啟動(dòng)子序列對(duì)HDAC抑制劑的活化敏感性不同。

2.4 FK228及抗腫瘤藥物對(duì)TA1和TA2啟動(dòng)子活化的影響

表1結(jié)果顯示，陽(yáng)性對(duì)照藥物FK228在COS-pTA1和COS-pTA2模型細(xì)胞RLU分別達(dá)到6和3以上，呈現(xiàn)出較高的相對(duì)熒光素酶活性。在敏感的COS-pTA1細(xì)胞中，雖然 DAC及紫杉醇處理組RLU＞1，表現(xiàn)出微弱的活化熒光素酶作用，但仍顯著低于FK228對(duì)特異性啟動(dòng)子TA1的活化水平(P＜0.01)。而COS-pTA1細(xì)胞維A酸處理組以及COS-pTA2細(xì)胞3種抗腫瘤藥物處理組的RLU均＜1，提示上述藥物處理對(duì)啟動(dòng)子TA1或TA2都不具有活化作用。同時(shí)，從這2種模型細(xì)胞對(duì)3種抗腫瘤藥物的反應(yīng)性來(lái)看，COS-pTA2比COS-pTA1具有較低的背景，僅對(duì)HDAC抑制劑產(chǎn)生特異性的活化作用，可以有助于排除藥物篩選過(guò)程中假陽(yáng)性的干擾。

表1 FK228，5-氮雜-2-去氧胞苷(DAC)，維A酸和紫杉醇對(duì)COS-pTA1和COS-pTA2模型細(xì)胞熒光素酶的活化作用Tab.1 Effect of FK228，5-aza-2'-deoxycytidine(DAC)，tretinoin and paclitaxel on luciferase activity in COS-pTA1 and Cos-pTA2 cells

2.5 采用COS-pTA1細(xì)胞模型篩選已知具有抗腫瘤活性的藥物

圖4結(jié)果顯示，在所篩選的6種樣品中，以RLU增加大于2為陽(yáng)性結(jié)果的判定標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，姜黃素和白藜蘆醇均顯示出具有一定的熒光素酶激活活性，而其他4種中藥提取物對(duì)熒光素酶的激活作用不顯著。上述結(jié)果提示該細(xì)胞模型用于篩選具有抑制HDAC活性的天然抗腫瘤活性藥物有一定應(yīng)用價(jià)值。

圖4 COS-pTA1細(xì)胞模型篩選具有抑制HDAC作用藥物.細(xì)胞分別用 TSA 600 nmol·L －1，姜黃素(Cur)20 μmol·L－1，槲皮素(Quer)100 μmol·L －1，大黃素(Em)50 μmol·L －1，芹菜素(Api)370 μmol·L －1，白藜蘆醇(Res)20 μmol·L －1及染料木素(GS)20 μmol·L－1作用24 h.±s，n=3.以RLU≥2為具有活性判定標(biāo)準(zhǔn).Fig.4 Screening of drugs with HDAC inhibition effect by COS-pTA1 cell model.

3 討論

前期研究表明，HDAC抑制劑通過(guò)促進(jìn)組蛋白的乙?；揎棧购诵◇w的空間構(gòu)象更加開(kāi)放，從而有利于各種轉(zhuǎn)錄因子接近DNA，促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄［3］。因此，筆者利用HDAC抑制劑對(duì)啟動(dòng)子可能的活化作用，篩選獲得了適宜的啟動(dòng)子，并在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染相關(guān)熒光素酶報(bào)道基因的細(xì)胞模型。當(dāng)采用HDAC抑制劑處理模型細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞模型中的外源啟動(dòng)子會(huì)得到活化而增強(qiáng)熒光素酶的表達(dá)，通過(guò)熒光素和熒光素酶生物發(fā)光體系測(cè)定，可以極其靈敏、高效地檢測(cè)出細(xì)胞在藥物處理前后熒光素酶活性的變化，借此判斷藥物是否具有HDAC抑制活性?？焖俸Y選結(jié)果表明，COS-pTA1細(xì)胞對(duì)于HDAC抑制劑具有較高的靈敏度，表現(xiàn)為細(xì)胞熒光素酶活性可以呈時(shí)間和濃度依賴性地增強(qiáng)。與COS-pTA1細(xì)胞相比，COS-pTA2細(xì)胞在相同的藥物劑量下反應(yīng)強(qiáng)度較低。DAC和維A酸可通過(guò)去甲基化及調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄而促進(jìn)細(xì)胞基因表達(dá)［6－7］，紫杉醇則可通過(guò)增強(qiáng)微管的穩(wěn)定性而影響HDAC6的活性［8］。細(xì)胞模型特異性結(jié)果顯示，在較為敏感的COS-pTA1細(xì)胞模型中，DAC和紫杉醇的確表現(xiàn)出高于本底的熒光素酶活性，但其反應(yīng)強(qiáng)度低于2倍，且不具有濃度依賴性，經(jīng)COS-pTA2細(xì)胞進(jìn)一步驗(yàn)證，也未能獲得重復(fù)的結(jié)果。證實(shí) TA1和 TA2啟動(dòng)子僅對(duì)HDAC抑制劑有較特異的活化反應(yīng)。采用COS-pTA1篩選6種具有抗腫瘤生物學(xué)活性的植物提取物是否具有HDAC抑制劑作用結(jié)果顯示，姜黃素和白藜蘆醇被檢出具有微弱的活性。已經(jīng)有文獻(xiàn)證實(shí)，姜黃素具有 HDAC抑制活性［9］，白藜蘆醇對(duì)HDAC的生物學(xué)效應(yīng)目前正在進(jìn)一步檢測(cè)之中。

綜上所述，筆者所建立的用于快速篩選具有HDAC抑制活性先導(dǎo)化合物的細(xì)胞模型中，COS-pTA1的作用特點(diǎn)是靈敏度高，可以有效避免因樣品活性低而出現(xiàn)漏檢。COS-pTA2的特點(diǎn)是檢測(cè)背景低，特異性強(qiáng)，可以有效排除假陽(yáng)性的篩選標(biāo)本。通過(guò)這兩種細(xì)胞模型的聯(lián)合篩選藥物，可以有效篩選具有HDAC抑制活性的化合物。該細(xì)胞模型為發(fā)現(xiàn)新型HDAC抑制劑的先導(dǎo)化合物及后續(xù)藥物研發(fā)提供了重要的技術(shù)平臺(tái)，具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

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