口蹄疫病毒T細胞表位研究概況

劉新生，王永錄

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蘭州獸醫(yī)研究所 家畜疫病病原生物學(xué)國家重點實驗室農(nóng)業(yè)部畜禽病毒學(xué)重點開放實驗室，甘肅 蘭州 730046)

在機體的免疫應(yīng)答過程中，免疫細胞通常難以借助其表面受體識別整個抗原分子，而只識別抗原大分子上的一個特定的部分，該部位稱為表位或抗原決定簇［1］。T、B細胞分別通過 T細胞抗原受體(T cell receptor，TCR)和B細胞抗原受體 (B cell receptor，BCR)識別抗原，介導(dǎo)細胞免疫和體液免疫，是適應(yīng)性免疫應(yīng)答的主要參與者。與B細胞對抗原的識別不同，T細胞不能識別完整的天然抗原分子，需要抗原提呈細胞 (APC)的協(xié)助，并且由組織相融性抗原復(fù)合物 (MHC)分子將表位肽段遞送至細胞表面才能識別。該過程包括抗原的加工和提呈、免疫突觸的形成，T細胞和APC間的相互作用，以及抗原肽與MHC分子、TCR分子間的相互作用等。

表位是蛋白質(zhì)抗原性的基礎(chǔ)，是抗原分子中誘生特異性免疫應(yīng)答的基本結(jié)構(gòu)和功能單位。根據(jù)結(jié)合表位的抗原受體細胞不同，將表位分為B細胞表位和T細胞表位［2］。線型表位見于 T細胞表位和部分B細胞表位，構(gòu)象型表位只見于B細胞表位。

口蹄疫 (foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD)是偶蹄動物的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，是世界上危害最嚴重的家畜傳染病之一。一般認為動物機體針對FMDV的抗感染免疫主要與高水平的抗體有關(guān)，因此對B細胞表位研究開展的較早且深入。但隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)細胞免疫在口蹄疫免疫應(yīng)答中也扮演著非常重要的角色。近年來，對口蹄疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白抗原上的T細胞表位進行了廣泛的研究并發(fā)現(xiàn)了許多新的T細胞表位。全面了解FMDV T細胞表位，對準確而詳盡地繪制其抗原表位圖譜、監(jiān)測病毒抗原變異、正確理解病毒致病的分子機制、定點改造免疫原性相關(guān)的蛋白質(zhì)分子以及口蹄疫病毒表位疫苗的研制具有重要意義。

1 T細胞表位研究方法

1.1 分類

T細胞表位是指在特異性免疫應(yīng)答中，抗原經(jīng)抗原遞呈細胞處理后，由MHC分子向T細胞表面抗原受體 (TCR)遞呈的線性肽段。T細胞對抗原的識別主要由 TCR-抗原表位-MHC分子的三聚復(fù)合體來完成。其中 MHC分子可以為MHCⅠ類和MHCⅡ類分子，雖然它們在結(jié)構(gòu)上有許多相似之處，但在免疫識別過程中所起的作用卻是不同的。MHCⅠ類分子主要提呈產(chǎn)生于抗原提呈細胞內(nèi)部的抗原肽，MHCⅠ類分子和抗原肽的復(fù)合物主要與CD8+CTL細胞上TCR結(jié)合，介導(dǎo)T細胞毒性免疫應(yīng)答，因此這類 T細胞表位被稱為CTL或CD8+T細胞表位;而MHCⅡ類分子主要遞呈從細胞外環(huán)境中攝取的抗原，MHCⅡ類分子和抗原肽的復(fù)合物主要與CD4+Th細胞結(jié)合，激活Th細胞以輔助B細胞產(chǎn)生抗體。這類T細胞表位稱為Th或CD4+T細胞表位。此外，活化的 Th細胞還產(chǎn)生一些細胞因子，介導(dǎo)NK細胞等免疫細胞產(chǎn)生細胞免疫應(yīng)答。

1.2 篩選方法

1.2.1 合成重疊肽法

合成重疊肽法是根據(jù)抗原蛋白的氨基酸序列隨機合成或連續(xù)合成一個或幾個重疊氨基酸的一系列肽段，然后通過淋巴細胞功能實驗確定可被T細胞識別的肽段，即T細胞表位。此法是目前確定T細胞表位研究中應(yīng)用最為廣泛的方法之一。雖然通過此方法已成功的確定了許多T細胞表位，且表位較可靠，但該方法有其局限性，主要是工作量大、費用高，而且由于合成的重疊肽一般是10個氨基酸，其中有5個氨基酸重疊，因此重疊區(qū)之間的表位就可能被忽略了，所以不能夠鑒定出目的蛋白上所有的T細胞表位。

1.2.2 計算機軟件預(yù)測法

此外，除了上述兩種方法外，質(zhì)譜分析技術(shù)［3］和噬菌體展示技術(shù)［4］也被應(yīng)用于 T細胞表位的篩選。

1.3 檢測方法

1.3.1 淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗

淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗 (lymphocyte transplant Test)(簡稱淋轉(zhuǎn))是利用淋巴細胞與抗原或有絲分裂原在體外共同培養(yǎng)，使淋巴細胞的代謝和形態(tài)發(fā)生一系列變化，進一步轉(zhuǎn)化為淋巴母細胞這一特性來反映機體免疫學(xué)狀態(tài)的一種測試方法，是細胞免疫的一個測定指標［5－6］。目前，在淋轉(zhuǎn)試驗中最常使用的兩種方法是MTT比色法和3H-TdR摻入法。

1.3.2 胞內(nèi)細胞因子染色法

抗原特異性 T細胞經(jīng)抗原表位肽短暫的、細胞因子分泌被抑制的體外刺激后，用多色流式細胞儀檢測產(chǎn)生細胞內(nèi)細胞因子，即可確定抗原特異性T細胞的頻率。胞內(nèi)細胞因子染色可準確地分析特定的CD4+T細胞和CD8+T細胞亞群的抗原特異性應(yīng)答，并可在一個抗原特異性T細胞中綜合分析多種細胞因子的分泌。胞內(nèi)細胞因子染色技術(shù)作為一種獨特的研究T細胞應(yīng)答的方法，已廣泛應(yīng)用于CD4+T細胞、CD8+T細胞表位的鑒定及其特異性應(yīng)答的研究中。

1.3.3 酶聯(lián)免疫斑點法

ELISPOT通過對T細胞分泌的各類細胞因子的檢測，間接的對機體內(nèi)分泌特定細胞因子的T細胞的頻率進行測定。其實驗原理是:由于受到刺激后的細胞會局部產(chǎn)生細胞因子，利用已被包被在固相上的特異性單克隆抗體對細胞因子進行捕獲，通過洗滌將細胞和未結(jié)合的其他細胞因子洗脫，加入生物素標記的識別另一表位的單克隆抗體，被捕獲的細胞因子與其結(jié)合，再與堿性磷酸酶標記的親和素結(jié)合，BCIP-NBT底物顯色后，可在PVDF膜上出現(xiàn)藍紫色斑點，可由此計算出分泌特定細胞因子的T細胞頻率。

技術(shù)組收到的稿件主要涉及三個方面:數(shù)字化教學(xué)與數(shù)碼互動、教學(xué)教改與創(chuàng)新、教學(xué)與科研技術(shù)的應(yīng)用與體會。同行報告展示了各自工作中教學(xué)及教學(xué)改革的經(jīng)驗和體會，以及教學(xué)與科研技術(shù)方面的應(yīng)用與技術(shù)改進的成果。通過參會代表的現(xiàn)場評選，并結(jié)合專家的評審意見，推舉出6篇教學(xué)和技術(shù)優(yōu)秀論文獎。

ELISPOT是單細胞水平的檢測，比 ELISA更靈敏，能從20萬～30萬細胞中檢出1個分泌該細胞因子的細胞。ELISPOT具有靈敏度高，所需細胞數(shù)較少的特點，比較適用于對較大數(shù)量抗原肽的大規(guī)模篩選。近年來報道的CTL表位和Th細胞表位絕大多數(shù)是用ELISPOT方法鑒定的。

1.3.4 MHC四聚體技術(shù)

四聚體技術(shù)將MHC重鏈的氨基端生物素化，生物素化的MHC-肽復(fù)合物可與熒光素 PE標記的鏈霉親和素結(jié)合，利用親和素上的4個生物素結(jié)合位點，將4個MHC分子交聯(lián)在一起形成一個復(fù)合物。這種熒光素標記的四聚體可與其抗原表位肽特異的CTL發(fā)生特異性結(jié)合，通過流式細胞儀即可有效地檢測特異性T細胞的頻率，應(yīng)用于表位特異性T細胞的研究。但由于應(yīng)用四聚體技術(shù)檢測特異性T細胞的每條肽都要和特定的MHC分子制備成四聚體，而四聚體的制備需要有良好的技術(shù)，費用也比較昂貴，不利于對T細胞表位進行大規(guī)模篩選，在一定程度上限制了四聚體技術(shù)在T細胞表位研究中的應(yīng)用。

1.3.551Cr釋放試驗

51Cr釋放試驗是經(jīng)典的研究 CTL表位的實驗方法。其實驗原理是效應(yīng)CTL識別靶細胞表面提呈的抗原肽-MHC復(fù)合物后，可對靶細胞發(fā)揮殺傷作用。用 Na512CrO4;標記靶細胞，若CTL能殺傷靶細胞，則51Cr從靶細胞內(nèi)釋出。以計數(shù)儀測定上清中51Cr的放射活性，就可測定效應(yīng)細胞的殺傷活性。但51Cr為放射性元素，受半衰期和同位素污染的限制。

1.3.6 熒光測定法

熒光測定法是近年來發(fā)展的，其原理是用相同或不同的熒光染料對靶細胞和效應(yīng)細胞進行染色，然后共同培養(yǎng)，根據(jù)熒光強度的變化，通過熒光掃描或流式細胞儀即可定量檢測特異性CTLs。

雖然新技術(shù)不斷出現(xiàn)，但每種方法都有其局限性，單一的方法不能夠進行全面準確的檢測，需要多種檢測方法相互結(jié)合使用，從而提高其準確性。

2 FMDV T細胞表位研究概況

2.1 FMDV基本特征

口蹄疫病毒 (foot and mouth disease virus，F(xiàn)MDV)是小 RNA病毒科 (picornaviridae)，口蹄疫病毒屬 (aphthovirus)的成員。到目前為止，已發(fā)現(xiàn)了7個血清型，即O、A、C型 (稱歐洲型)，SAT1、SAT2、SAT3(南非 1、2、3型，稱非洲型)和Asia(亞洲型)，群內(nèi)各型同源性達60% ～70%，但兩群之間同源性僅為25% ～40%，血清型間無血清交叉和交叉免疫現(xiàn)象。FMDV為正二十面體結(jié)構(gòu)，直徑20～30 nm，分子量為6.9×106 u，沉降系數(shù)為140～146 S。完整的病毒顆粒包括衣殼和RNA部分，其基因組編碼4個結(jié)構(gòu)蛋白(VP1、VP2、VP3、VP4)和8個非結(jié)構(gòu)蛋白 (L、1A、1B、1C、1D、2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D)。

2.2 FMDV T細胞表位

2.2.1 結(jié)構(gòu)蛋白T細胞表位

FMDV 感染時中和抗體的產(chǎn)生需要B細胞表位和T細胞表位的相互作用，缺少了T細胞表位的疫苗不能夠刺激機體產(chǎn)生有效地免疫保護［7］。這說明T細胞表位在FMDV的抗原構(gòu)成和免疫應(yīng)答中也起著很重要的作用。

Th細胞屬于CD4 T細胞亞群，主要協(xié)助其它免疫細胞發(fā)揮功能，如輔助B細胞分化和合成抗體、增加其它CD8 T細胞的增殖功能使其更好的發(fā)揮殺傷靶細胞的功能、協(xié)助巨噬細胞產(chǎn)生遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)等。Th細胞是有效實施龐大的特異性免疫應(yīng)答的必要保證。使被抗原活化的B淋巴細胞產(chǎn)生抗體和抗體特異性細胞毒性T淋巴細胞 (Tc)變成效應(yīng)器細胞都必須與受抗原刺激的Th相互作用。對合成肽研究過程中發(fā)現(xiàn)，合成肽的低免疫原性與缺乏Th細胞表位有關(guān)，而通過增加額外的Th細胞表位可以克服FMDV合成肽反應(yīng)的MHC限制性。因此，Th細胞表位的不斷深入研究，對口蹄疫的免疫學(xué)研究有著重要意義。FMDV VP1的G-H Loop中不僅有誘導(dǎo)B細胞的位點，而且存在激發(fā)輔助性T細胞 (Th細胞)的位點。

1991年，Collen等［8］通過淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)MDV140S、12S和分離的 VP1-3均能在體外刺激牛的淋巴細胞增殖，并確定了刺激活性的殘基位于 VP1的21～40位以及 161-碳末端序列。由于VP3誘導(dǎo)了淋巴細胞轉(zhuǎn)化，說明VP3上也包含Th細胞表位，并證實口蹄疫病毒的Th表位有改善肽疫苗免疫原性的潛能。1994年，Rodriguez等［9］在豬抗 FMDV結(jié)構(gòu)蛋白 VP1的抗原特異性T細胞研究中，將目的蛋白在大腸桿菌中表達，并通過淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗，在體外對免疫動物的PBMC進行刺激，發(fā)現(xiàn)在VP1上存在有Th細胞表位，進一步的實驗表明，該位點能克服牛MHC的遺傳限制。同年，Zamorano等［10］確定在VP1的135～144和150～160位氨基酸殘基上存在2個T細胞表位，并且在牛的抗FMDV免疫作用中起到了積極的作用。1995年，Lierop等［11］以牛為實驗動物，分離免疫動物的外周單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell PBMC)，通過淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗證實在VP1的140～160位存在T細胞表位。2007年，Wang等［12］以豚鼠為模型，對Asia1型FMD YNBS/58株研究發(fā)現(xiàn)在VP1的133～163位、VP2的1～33位氨基酸包含有抗原位點，兩者均可誘導(dǎo)豚鼠的淋巴細胞增殖。

關(guān)于FMDV T細胞表位的研究最初主要集中在VP1上，后來才擴展到病毒的其它結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)蛋白上。近年來，對其他結(jié)構(gòu)蛋白的研究也在不斷的深入。1999年，Toja等［13］對C型 FMDV研究后證實，在FMDV衣殼蛋白上有多個能被牛和豬淋巴細胞識別的T細胞表位。2000年，Blanco等［14］通過合成重疊肽法合成了覆蓋FMDV結(jié)構(gòu)蛋白VP4全長的14個肽段，利用淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗確定在VP4的20～34位存在T細胞表位。然后他們又將確定的此T細胞表位與結(jié)構(gòu)蛋白VP1上137～156位的1個B細胞表位串聯(lián)后再1次進行淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗，發(fā)現(xiàn)與此T細胞表位單獨刺激的結(jié)果相比，T，B細胞表位串聯(lián)后刺激豬的PBMC細胞增殖的效力減弱，但比B細胞表位單獨刺激的效力要強。同年，F(xiàn)ilgueira等［15］使用小鼠模型，通過淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗研究了結(jié)構(gòu)蛋白 VP2、VP3和VP4上的T細胞位點，發(fā)現(xiàn)在FMDV O1C株的結(jié)構(gòu)蛋白VP2、VP3和VP4上至少存在10個T細胞表位，其中VP2上49～68位、113～132位、179～198位，VP3上81～100位、129～148位，VP4上17～36位，都具有明顯有效的Th刺激功能。

2.2.2 非結(jié)構(gòu)蛋白T細胞表位

FMDV非結(jié)構(gòu)蛋白在免疫保護性應(yīng)答中也起著積極的作用。而且，非結(jié)構(gòu)蛋白在各個血清型之間較為保守，其上有些T細胞表位可產(chǎn)生交叉性免疫保護。因此，非結(jié)構(gòu)蛋白上T細胞表位的研究也是十分重要的。1998年，F(xiàn)oster等［16］系統(tǒng)的研究了非結(jié)構(gòu)蛋白對被不同血清型的FMDV感染動物的體液和細胞免疫反應(yīng)，并確定FMDV 3D上存在T細胞表位。2001年，Blanco等［17］通過合成重疊肽法，利用T細胞增殖實驗研究了FMDV非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC上的T細胞表位，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在3A上21～35位存在 T細胞表位。2004年，Garcia-Briones等［18］經(jīng)淋巴細胞增殖試驗檢測得出，對FMDV3D蛋白識別的T細胞屬于Th細胞亞群，3D蛋白包含能有效的識別豬T淋巴細胞的表位，而異源病毒相對于接種的重組雞痘病毒的3D來說不能獲得保護。2006年，Wilhelm Gerner［19］通過合成肽重疊法合成了覆蓋FMDV3D的15肽，分離被免疫的豬的PBMC，然后與候選表位進行淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗，篩選出 FMDV非結(jié)構(gòu)蛋白3D346aa～370aa存在T細胞表位，并用ELISPOT實驗檢測了其正確性。

2.3 FMDV表位疫苗

表位疫苗是指同時攜帶多個目標抗原相關(guān)表位以及輔助性表位的疫苗。通過分子生物學(xué)手段可篩選出病毒的B細胞和T細胞表位，以及其它淋巴細胞表位，同時對表位進行優(yōu)化，從而研制出多表位疫苗。多表位疫苗有能克服MHC分子的遺傳限制，可被多種遺傳背景的MHC分子識別結(jié)合，并被高效遞呈等優(yōu)勢。由于傳統(tǒng)FMD滅活疫苗有自身的一些缺陷，如滅活不完全，可能引起散毒和不能產(chǎn)生交叉保護等，所以研制更加高效安全的新型疫苗就十分必要。表位疫苗作為一種新的疫苗設(shè)計思路，已逐步成為口蹄疫新型疫苗研究中的熱點。

FMDV粒子T細胞表位的不斷確定為構(gòu)建表位疫苗奠定了堅實的基礎(chǔ)?，F(xiàn)國內(nèi)外很多學(xué)者都致力于此項研究，并已取得了一定的進展，如:Chang Yi Wang等［20］設(shè)計了包含有一個 Th細胞表位的口蹄疫多肽疫苗，并在豬的免疫保護實驗中起到了有效的保護作用。Marchi等［21］曾報道，將串聯(lián)有FMDV VP1第140～160和第200～213氨基酸殘基的合成肽免疫牛后，動物能抵抗病毒的感染。但隨后的研究證實，當(dāng)將此類合成肽疫苗在易感動物群內(nèi)大規(guī)模使用時，卻僅能提供有限的保護［22］。究其原因，缺乏輔助性T細胞表位可能是影響該疫苗效果的一個因素。同時攜帶B細胞抗原表位A和T細胞抗原表位 (VP121～140)的串聯(lián)合成肽已經(jīng)被證明對牛表現(xiàn)出良好的免疫反應(yīng)性。Zamorano等［23］用O型口蹄疫 VP1的135～160氨基酸殘基上包含有T和B細胞優(yōu)勢表位免疫牛，產(chǎn)生了強烈的中和抗體反應(yīng)，雖然135～144不能引發(fā)抗體反應(yīng)，但其重復(fù)串聯(lián)序列卻可以誘導(dǎo)有效而且強烈的中和抗體反應(yīng)。用腺病毒構(gòu)建了含口蹄疫VP1的3個氨基酸殘基表位 (21～60、141～160、200～213)的重組腺病毒 (rAd-GMCSF-VPe)，并與豬的巨噬細胞集落刺激因子混合接種豚鼠和豬，能檢測到高水平的T細胞增殖、IL-4和IFN，并伴有特異性的體液免疫應(yīng)答。構(gòu)建的共表達FMDV復(fù)合多表位基因以及豬IL-18基因的非復(fù)制型重組雞痘病毒疫苗vU-TA2-OAT以及DNA疫苗pVRI-OAT，將上述2種重組疫苗分別單獨或聯(lián)合接種豚鼠，測定FMDV特異性結(jié)合抗體、中和抗體和T淋巴細胞增殖反應(yīng)。結(jié)果表明這2種重組疫苗均能誘導(dǎo)豚鼠產(chǎn)生特異性的體液免疫及細胞免疫應(yīng)答，其中以pVRI-OAT/vUTA2-OAT的聯(lián)合免疫方式的效果最好，其誘導(dǎo)的抗體水平接近于常規(guī)滅活疫苗，而細胞免疫水平則比后者高得多。

3 展望

大量的研究結(jié)果證實，要更加深入的研究FMDV的致病及免疫機理、設(shè)計構(gòu)建更加安全有效的新型口蹄疫疫苗，需要盡最大可能地闡明針對FMD免疫的各類T細胞表位。只有包含有效的T細胞表位，設(shè)計出的新型FMD疫苗才能跟好的預(yù)防和控制FMD。相信隨著各種技術(shù)的不斷發(fā)展，對T細胞表位的研究方法將不斷豐富和完善，對FMDV T細胞表位的認識也將不斷深入，從而使FMDV的研究更加全面和深入。

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