油菜菌核病的致病機(jī)理和生物防治

朱小惠，陳小龍

(浙江工業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院發(fā)酵工程研究所，浙江杭州 310032)

油菜菌核病菌 (Sclerotinia sclerotiorum(Lib.)de Bary)也稱為油菜核盤菌，是一種世界性的腐生型病原真菌。該菌主要分布于溫帶和亞熱帶，寄主范圍十分廣泛，可寄生75科400多種植物［1］。此病一旦發(fā)作，常會(huì)連年發(fā)生，導(dǎo)致農(nóng)作物產(chǎn)量和質(zhì)量大幅度下降，最嚴(yán)重可以使油菜減產(chǎn)50%，嚴(yán)重影響了油菜生產(chǎn)［2］。

目前，化學(xué)農(nóng)藥是防治菌核病的主要手段，但是由于長(zhǎng)期、反復(fù)和大量使用化學(xué)農(nóng)藥存在著潛在危害，不僅會(huì)給人類健康和環(huán)境帶來(lái)危害，而且還會(huì)帶來(lái)非靶標(biāo)生物的影響及病原菌的抗藥性等問(wèn)題。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，利用拮抗微生物作為生物殺真菌劑防治油菜菌核病已經(jīng)是替代化學(xué)農(nóng)藥的潛在有效方法［3］。世界各國(guó)對(duì)油菜菌核病的致病機(jī)理、生物防治等方面進(jìn)行了大量的研究，并且已取得了可喜的成績(jī)，現(xiàn)就國(guó)內(nèi)外的研究動(dòng)態(tài)與進(jìn)展作一綜述。

1 致病機(jī)理

1.1 有關(guān)酶

1.1.1 角質(zhì)酶

寄主表皮的角質(zhì)成分是病原菌成功侵入需要突破的第1道屏障［4］。角質(zhì)酶是病菌產(chǎn)生的突破角質(zhì)層的主要工具酶，能催化角質(zhì)多聚物水解。病菌在侵入前可產(chǎn)生少量的角質(zhì)酶分解寄主表皮的角質(zhì)層，釋放少量的單體，這些單體物質(zhì)可以誘導(dǎo)角質(zhì)酶編碼基因表達(dá)，合成更多的角質(zhì)酶，加速降解寄主的表皮角質(zhì)層。

1.1.2 細(xì)胞壁降解酶

羅寬［5］認(rèn)為細(xì)胞壁是病原物侵入寄主植物的主要屏障，它的主要成分包括果膠質(zhì)、纖維素、半纖維素、木質(zhì)素和糖蛋白等。針對(duì)植物細(xì)胞壁中的每一種成分，植物病原物有相應(yīng)的果膠酶、纖維素酶、半纖維素酶、木質(zhì)素降解酶和蛋白酶等細(xì)胞壁降解酶。

果膠酶 (pectinase)。在植物病原物的細(xì)胞壁降解酶中，研究最多的是果膠酶。根據(jù)它們的作用區(qū)分，果膠酶可分為2類:果膠水解酶和裂解酶和果膠甲基酯酶。果膠水解酶的作用是斷裂α-1，4-糖苷鍵，釋放出單體半乳糖醛酸，裂解酶的作用除使糖苷鍵斷裂外，還能消除第5個(gè)碳原子上的氫，因而最終釋放出不飽和的二聚物。果膠甲基酯酶的作用是從果膠質(zhì)中除去甲基產(chǎn)生果膠酸，它還可以分解果膠鏈上的小分枝，但對(duì)果膠分子主鏈的長(zhǎng)度沒(méi)有影響［6］。果膠酶主要作用于果膠類物質(zhì)，降解植物細(xì)胞壁中的果膠成分，導(dǎo)致組織解體從而引起軟腐、干腐、枯萎、斑點(diǎn)等癥狀。植物組織的浸解 (maceration)是軟腐病的典型癥狀，這種癥狀的發(fā)生是由于連結(jié)細(xì)胞的胞間層被病原物的酶分解，使寄主細(xì)胞彼此分離，組織軟化而呈水漬狀。植物細(xì)胞胞間層的主要成分是果膠物質(zhì)，因此人們認(rèn)為果膠酶是使組織浸解的主要因素，其中內(nèi)切多聚半乳糖醛酸酶和內(nèi)切果膠酸裂解酶是效率最高的酶。除浸解組織外，果膠酶還引起細(xì)胞的死亡。關(guān)于細(xì)胞死亡的原因曾經(jīng)有很多假說(shuō)，實(shí)驗(yàn)證明，果膠酶引起的細(xì)胞死亡，并不是由于果膠酶對(duì)細(xì)胞的直接殺傷作用或在降解細(xì)胞壁過(guò)程中產(chǎn)生的有毒物質(zhì)引起的，其主要原因可能是果膠酶降解中膠層和多糖組分后，初生細(xì)胞壁松弛，壁壓下降，原生質(zhì)膜在低滲透壓下脹裂，導(dǎo)致細(xì)胞的死亡。

纖維素酶 (cellulase)。纖維素是由葡萄糖分子鏈構(gòu)成的多糖類化合物。核盤菌可以分泌纖維素酶將纖維素降解為可溶性纖維二糖，再由 β-葡萄糖苷酶將纖維二糖降解為葡萄糖。纖維素酶介導(dǎo)的酶促反應(yīng)的最適pH為3.0。在感病組織中，核盤菌可適應(yīng)性產(chǎn)生纖維素酶，而且感病組織中纖維素的含量隨著病程的推移逐漸下降，從而使細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。劉小燕等人已經(jīng)證明油菜菌核病菌菌株的致病力強(qiáng)弱與其纖維素酶活性高低成正相關(guān)［7］。

半纖維素酶 (hemicellulase)。半纖維素是由半乳糖、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖等多種糖類物質(zhì)構(gòu)成的異質(zhì)多糖。半纖維素酶包括:木聚糖酶、半乳聚糖酶、葡聚糖酶、阿拉伯聚糖酶、甘露聚糖酶等，均屬于聚糖水解酶。在這些酶的共同作用下，酶解半纖維素，破壞和分解植物細(xì)胞壁。

1.1.3 細(xì)胞膜和細(xì)胞內(nèi)含物降解酶

植物病原菌還能產(chǎn)生一些降解細(xì)胞膜和細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的酶，如蛋白酶、脂酶、淀粉酶等，用以降解蛋白質(zhì)、類脂和淀粉等成分。核盤菌產(chǎn)生的蛋白酶可以降解寄主原生質(zhì)和細(xì)胞壁中的蛋白組分，破壞植物細(xì)胞壁糖蛋白，利于病菌入侵，這種酶在許多感病寄主組織中都有發(fā)現(xiàn)，接種2 d后就可檢測(cè)到蛋白酶活性，10 d后蛋白酶的活性最高［8－9］。

1.2 致病機(jī)制

官春云［10］認(rèn)為在整個(gè)病程中，病菌的營(yíng)養(yǎng)可能是決定病菌在寄主中建立寄生關(guān)系成敗的重要因素，侵染前底物的可利用性是侵染成功的先決條件。病菌侵入組織后，需要大量的能源，只有豐富的易利用的營(yíng)養(yǎng)才能提供病原菌的生長(zhǎng)繁殖。纖維素酶、半纖維素酶、外PG、磷脂酶、蛋白質(zhì)水解酶和其他酶類在發(fā)病過(guò)程中可能起一種分解寄主組織提供營(yíng)養(yǎng)的作用。降解細(xì)胞壁的纖維素酶可由病菌的分枝菌絲產(chǎn)生，使細(xì)胞廣泛被降解，從而提供了豐富的可利用的碳水化合物，使侵染菌絲能在細(xì)胞間充分分支與定植，接種后第2天侵染組織中纖維素含量減少，就是一個(gè)例證，半纖維素酶也一樣。病菌生長(zhǎng)和產(chǎn)生細(xì)胞外酶所需的氮源可能由磷脂酶和蛋白酶提供。

草酸在病原菌的致病性、與環(huán)境微生物的競(jìng)爭(zhēng)、養(yǎng)分的獲得、毒素的調(diào)節(jié)及木質(zhì)素的降解上發(fā)揮著重要作用［11］。Debary最先提出，草酸作為一種菌核病菌分泌的有毒代謝物與菌核病致病性有關(guān)，隨后 Max Well等［12－13］從被侵染的大豆組織中檢測(cè)到草酸鹽的存在。吳純?nèi)实龋?4－15］對(duì)感病寄主組織中草酸的積累和分布晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究，進(jìn)一步證明了草酸在油菜菌核病致病中的作用，發(fā)現(xiàn)不同感病程度的組織內(nèi)草酸含量的變化不同。草酸的作用機(jī)理至今尚不清楚，據(jù)推測(cè)主要有以下幾點(diǎn):草酸降低了寄主細(xì)胞的pH值，從而有利于病菌的細(xì)胞壁降解酶的活性，加速了寄主細(xì)胞解體。因?yàn)檫@些酶如內(nèi)或外PG，纖維素酶，半纖維素酶都是酸性酶;草酸抑制了與抗性有關(guān)的酶和光合作用的酶活性;草酸和鈣結(jié)合成草酸鈣晶體有可能堵塞導(dǎo)管或微管束而導(dǎo)致萎蔫;草酸對(duì)寄主細(xì)胞的直接毒害作用，表現(xiàn)在草酸有強(qiáng)的離子螯合能力，能改變寄主細(xì)胞膜透性，引起電解質(zhì)喪失，破壞葉綠體結(jié)構(gòu)，為病菌提供了營(yíng)養(yǎng)和生存環(huán)境。

綜上所述，核盤菌產(chǎn)生的多種酶類和毒素-草酸，是導(dǎo)致植物發(fā)病，組織死亡的重要原因，并且酶 (內(nèi)PG、蛋白酶)和毒素-草酸與菌株致病成正相關(guān)。

2 生物防治及作用機(jī)制

生物防治會(huì)對(duì)病原植物真菌和植物產(chǎn)生直接或者間接的影響，拮抗微生物防治植物病害所涉及的因素很多，其作用方式也各有不同，目前研究得比較清楚的主要有以下4個(gè):拮抗作用、營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)、重寄生、誘導(dǎo)植物系統(tǒng)獲得抗病性。至今人們已分離篩選到對(duì)油菜菌核病有不同防治效果的各類微生物，有些已經(jīng)進(jìn)入實(shí)際應(yīng)用階段。

2.1 拮抗作用

拮抗微生物通過(guò)產(chǎn)生特異性或者非特異性的代謝產(chǎn)物或者抗生素來(lái)抑制或者破壞病原菌的生長(zhǎng)。木霉 (Trichodermaspp.)能產(chǎn)生很多拮抗物質(zhì)［16］，木霉菌在代謝過(guò)程中能產(chǎn)生多種水解酶和抗生素。如幾丁質(zhì)酶 (chitinase)、纖維素酶(cellulase)、木聚糖酶 (xylanese)、葡聚糖酶(glucanase)和蛋白酶 (proteinase)可抑制病菌孢子萌發(fā)，引起菌絲崩解。次生代謝產(chǎn)生的抗生素主要有木霉素 (trichodermin)、膠毒素 (gliotoxin)、綠木霉素 (viridin)、膠綠木霉素 (glioviridin)和抗菌肽 (peptideantibiotic)等［17］，這些次生代謝物可以抑制植物病原菌的生長(zhǎng)而發(fā)揮其生防作用，其中木霉素具有抑制核盤菌生長(zhǎng)和子囊盤產(chǎn)生的作用。

產(chǎn)生抗生素及細(xì)胞外細(xì)胞壁分解酶是粘帚霉屬(Gliocladiumspp.)抗真菌的重要機(jī)制之一［18］。綠色粘帚霉 (Gliocladium virens)能夠產(chǎn)生抗真菌代謝物如膠霉毒素 (gliocladiu)、綠膠霉素(gliovirin)。暴增海等研究表明粘帚霉發(fā)酵液能夠降低菌核病的發(fā)病率，防治效果達(dá)到80%以上［19］。目前已從盾殼霉 (Coniothyrium minitans)培養(yǎng)濾液中鑒定出至少3類代謝物質(zhì):3(2H)-苯丙呋喃酮類、色烷類［20］和 macrosphelide A［21］。其中，macrosphelide A是最主要的代謝物質(zhì)，對(duì)核盤菌的IC50為46.6 mg·kg－1。此外，盾殼霉培養(yǎng)液中還存在β-1，3-葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶，這些酶可降解核盤菌菌絲及菌核擬薄壁組織的細(xì)胞壁［22］。毛殼菌 (Chaetomiumspp.)產(chǎn)生的拮抗物質(zhì)chaetoglobusinC可以有效的抑制菌核病，chaetoviridins A和B能夠抑制菌核病菌絲的生長(zhǎng)［23］。周樂(lè)聰?shù)龋?4］篩選出紅蛋巢菌 BNF71 和BNFl37菌株，其培養(yǎng)液對(duì)油菜菌核病具有良好的防治效果，防效分別達(dá)98.8%和86.1%，這2株生防菌具有較高的木聚糖酶活性，而另一株菌BNF134具有顯著的外幾丁質(zhì)酶活性。

Femando等［25］研究發(fā)現(xiàn)假單胞菌30-84菌株在Kanner培養(yǎng)基中產(chǎn)生吩嗪類抗生素，可以完全抑制核盤菌菌核的產(chǎn)生。Thomashow等［26］發(fā)現(xiàn)熒光假單胞2-79RN10產(chǎn)生的吩嗪類抗生素能抑制核盤菌菌絲的生長(zhǎng)。江木蘭等［27］研究發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilis)BY-2能產(chǎn)生2種類型的抗真菌物質(zhì)，一種是揮發(fā)性的物質(zhì)，可以有效地抑制油菜菌核病菌的生長(zhǎng);另一種是分泌到培養(yǎng)液中的物質(zhì)，試驗(yàn)證明BY-2產(chǎn)生和積累的高效抑制油菜菌核病菌生長(zhǎng)的細(xì)胞外分泌型物質(zhì)，其發(fā)酵上清液與油菜菌核病菌對(duì)峙培養(yǎng)形成了2.8 cm的抑菌圈。

孫啟利等［28］研究表明地衣芽孢桿菌 (Bacillus licheniformis)W10培養(yǎng)菌液和濾液對(duì)油菜菌核病

菌具有較強(qiáng)的頡頑能力。經(jīng)硫酸銨沉淀和透析而提取的W10抗菌蛋白顯著抑制病菌生長(zhǎng)，當(dāng)?shù)鞍诐舛葹?00 μg·mL－1時(shí)，對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制率在90%以上，而且菌核不能產(chǎn)生，處理菌核后菌核萌發(fā)推遲，明顯抑制子囊孢子萌發(fā)和芽管伸長(zhǎng)。Liping Yang等［29］研究發(fā)現(xiàn)青霉菌PY-1產(chǎn)生的抗真菌物質(zhì)能夠抑制核盤菌菌絲生長(zhǎng)，抗菌物質(zhì)經(jīng)乙酸乙酯萃取和高效液相色譜的分離后，出現(xiàn)2個(gè)活性組分。

2.2 競(jìng)爭(zhēng)作用

微生物間的競(jìng)爭(zhēng)作用發(fā)生在當(dāng)空間和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)成為限制性因子的條件下［30］。對(duì)于一些生長(zhǎng)較快的生防真菌如木霉菌和葡萄孢來(lái)講，空間和營(yíng)養(yǎng)的競(jìng)爭(zhēng)可能是防治病害的一個(gè)重要的機(jī)制，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)和消解某些毒性物質(zhì)，達(dá)到控制病害的目的。木霉菌屬于腐生型真菌，適應(yīng)性強(qiáng)，生長(zhǎng)繁殖快，能夠迅速利用營(yíng)養(yǎng)和占據(jù)空間。研究表明:無(wú)論采用土壤處理還是種子處理，木霉都能夠很容易地沿著被處理植物的根系生長(zhǎng)。在離子饑餓狀態(tài)下，木霉能分泌高效率的鐵載體來(lái)螯合環(huán)境中的離子，競(jìng)爭(zhēng)土壤中有限的營(yíng)養(yǎng)成分從而抑制病原微生物的生長(zhǎng)［31］。從油菜花瓣上分離的葡萄孢菌能快速生長(zhǎng)，迅速占領(lǐng)花瓣空間，從而阻止核盤菌子囊孢子的定殖，減輕菌核病的發(fā)生［32］。另外，盾殼霉能在油菜和苜蓿等植物的花瓣上抑制核盤菌子囊孢子的定殖及其侵染葉片或果莢［33］。

2.3 重寄生作用

重寄生作用是生防真菌防治植物病害過(guò)程中一個(gè)普遍的現(xiàn)象。其中盾殼霉因其專一性強(qiáng)，作用時(shí)間長(zhǎng)，對(duì)植物無(wú)致病性等特點(diǎn)而被認(rèn)為是最具開(kāi)發(fā)潛力的生防菌之一［34］。盾殼霉的菌絲可直接穿透核盤菌菌絲和菌核，導(dǎo)致菌核組織破壞和解體，胞質(zhì)裂解，變空，胞壁溶解，而其自身正常［35］。通過(guò)光學(xué)顯微鏡，透射電鏡 (TEM)和掃描電鏡(SEM)觀察發(fā)現(xiàn)，盾殼霉通過(guò)機(jī)械壓力侵入皮層細(xì)胞壁并破壞細(xì)胞內(nèi)含物，侵入髓部菌絲時(shí)則是依靠酶解和機(jī)械壓力的共同作用。盾殼霉分泌的與降解寄主的細(xì)胞壁相關(guān)的酶主要是 β-1，3-葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶。Giczey等［36］克隆了盾殼霉的 β-1，3-葡聚糖酶基因cmgL，并發(fā)現(xiàn)在寄生菌核的過(guò)程中，cmgL的表達(dá)增強(qiáng)，可見(jiàn)這種酶是盾殼霉寄生核盤菌過(guò)程中的關(guān)鍵酶。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為木霉菌在侵染穿透寄主真菌的過(guò)程中所產(chǎn)生的真菌細(xì)胞壁降解酶(幾丁質(zhì)酶、葡聚糖酶、蛋白酶等)起著直接作用，又以幾丁質(zhì)酶和葡聚糖酶的作用為重要。Davet等［37］認(rèn)為，木霉的 β-1，3-葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶活力越高，對(duì)核盤菌的重寄生作用越強(qiáng)。此外，學(xué)者還專門研究了作用于菌核上的重寄生菌。馬桂珍等［38］在研究大豆菌核病菌菌核重寄生菌時(shí)，經(jīng)大量篩選獲得一株對(duì)菌核有強(qiáng)寄生能力的鏈孢粘帚霉菌株 (G.catenulatum)HL-1-1，該菌株室內(nèi)對(duì)菌核的寄生率達(dá)100%，被寄生菌核不能萌發(fā)，并使90%以上的菌核腐爛，溫室盆栽試驗(yàn)對(duì)核盤菌引起的大豆菌核病防效達(dá)80%以上，在寄生菌核的過(guò)程中能分泌大量的幾丁質(zhì)酶和葡聚糖酶。食菌核葚孢霉 (Sporidesmium sclerotivorum)是1978年美國(guó)農(nóng)業(yè)部研究人員在研究萵苣菌核病菌(Scterotinia minor)時(shí)，于馬里蘭州首次發(fā)現(xiàn)的［39］，該菌是一種專門寄生于多種核盤菌科真菌菌核上的重寄生菌，通過(guò)機(jī)械力侵入菌核皮層后，菌絲在皮層和髓部的細(xì)胞間活躍地生長(zhǎng)。食菌核葚孢霉寄主?；詮?qiáng)，僅專性寄生于某些核盤菌科真菌的菌核上，寄生率高，在小核盤菌菌核密度為每100 g土壤616個(gè)時(shí)，接種劑量為每1 g土壤5個(gè)大孢子即可成功侵染［40］。

2.4 誘導(dǎo)抗性

植物在遇到有害生物侵襲時(shí)，能形成一種獨(dú)特的防御系統(tǒng)［41］?；诓煌愋?，不同來(lái)源和不同數(shù)量的刺激源，宿主植物的誘導(dǎo)抗性可以是局部的誘導(dǎo)抗性 (過(guò)敏性反應(yīng))或者是系統(tǒng)的誘導(dǎo)抗性［42］。Dean 等［43］在 1989 年發(fā)現(xiàn)綠色木霉在以 D-木糖、木聚糖或者天然植物細(xì)胞壁制備物為原始碳源的培養(yǎng)基中，能夠產(chǎn)生木聚糖酶，植物在木聚糖酶作用下，具有明顯的防御反應(yīng)，能夠增強(qiáng)對(duì)植物真菌的抗性。殼寡糖作為近幾年研究較多的一種植物誘抗劑，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于煙草、棉花、油菜等作物生產(chǎn)中。尹恒等［44］首次進(jìn)行了殼寡糖對(duì)油菜抗菌核病的研究，證實(shí)了殼寡糖使油菜對(duì)菌核病產(chǎn)生抗性主要是因?yàn)闅す烟钦T導(dǎo)油菜產(chǎn)生了系統(tǒng)抗性。邱業(yè)先等［45］在篩選油菜菌核病抗性誘導(dǎo)菌過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)桃褐腐病菌對(duì)油菜離體葉片和盆栽植株均不致病，但經(jīng)誘導(dǎo)接種后，可明顯誘導(dǎo)植株對(duì)菌核病的抗性，當(dāng)用油菜菌核病菌進(jìn)行激發(fā)接種后，接種植株僅表現(xiàn)輕微癥狀，其莖、葉發(fā)病率和病情指數(shù)遠(yuǎn)低于未經(jīng)誘導(dǎo)的植株。

3 展望

核盤菌的侵染循環(huán)具有土傳和氣傳雙重特征，菌核能頑固地存活于土壤中越冬和越夏，菌核還可通過(guò)種子進(jìn)行遠(yuǎn)距離傳播，這種流行特點(diǎn)給菌核病的防治帶來(lái)了困難。認(rèn)識(shí)核盤菌致病機(jī)制，可以尋找抗病基因以獲得轉(zhuǎn)基因植物來(lái)進(jìn)行遺傳改良，以達(dá)到防治核盤菌的目的。

盡管國(guó)內(nèi)外對(duì)核盤菌生防菌研究較多，但真正登記注冊(cè)的生防制劑很少。迄今為止，形成制劑的生防菌主要為盾殼霉。主要有:俄羅斯1989年研制出用于防治向日葵菌核病的盾殼霉制劑coniothyrin，德國(guó)和瑞士研究用于防治蔬菜及大田作物菌核病的 conitans盾殼霉商品制劑 (德國(guó)Prophyta Biologisoher Ptanzenschutz公司)，以及匈牙利研制用于防治溫室及園藝作物菌核病的KON(bioveditd sligetszontmiklos)盾殼霉商品制劑。此外印度Biotech International公司生產(chǎn)的綠色木霉可濕性粉劑可用于菌核病的防治［46］。pseudomonas cepacia和bacillus subtilis制劑已在臺(tái)灣注冊(cè)用于防治棉花立枯病和油菜菌核?。?7］。

隨著人們?cè)絹?lái)越關(guān)注食品的安全性，繼續(xù)開(kāi)發(fā)和挖掘其他的有益微生物和具有安全性的植物源拮抗活性物質(zhì)資源將成為未來(lái)研究的熱點(diǎn)。

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