卵黃抗體在防治仔豬腹瀉上的應(yīng)用

崔桂清,李火舉

(1.廊坊市動物疫病預(yù)防控制中心,河北 廊坊 065000;2.北京海思科瑞科技有限公司,北京 大興 100176)

卵黃抗體(IgY)是蛋雞受特定抗原刺激后體內(nèi)會產(chǎn)生特異性并被轉(zhuǎn)移和貯存在卵黃中的免疫球蛋白[1]。卵黃抗體的研究始于19世紀(jì)末至20世紀(jì)初,1889年,Klemperer發(fā)現(xiàn)了卵黃中富含抗體;1934年,Jukes的試驗證明母雞血清中的抗體可以轉(zhuǎn)移到卵黃中,從而為雛雞提供被動免疫保護(hù)。Patterson等(1962)試驗證實:相對別的血漿蛋白,IgG被選擇性地轉(zhuǎn)運到卵泡中。1969年,Leslie和Clem將這種抗體命名為 IgY。Roth等(1981)和Locken等(1983)提出并證實IgY轉(zhuǎn)運到卵泡的過程是受體依賴性的,認(rèn)為卵巢的IgY受體使得血液中所有的IgY亞群被選擇性轉(zhuǎn)運到卵泡中。存在于禽卵黃中的免疫球蛋白主要是 IgY、IgM、IgA和IgD含量極少。

1 卵黃抗體(IgY)

1.1 IgY抗體結(jié)構(gòu) IgY大分子的結(jié)構(gòu)與哺乳動物免疫球蛋白類似。Warr等(1995)通過分子結(jié)構(gòu)分析認(rèn)為IgY是哺乳動物體內(nèi)IgG和IgM的進(jìn)化前體。IgY 中Cυ 3和Cυ 4區(qū)與哺乳動物IgG 的Cγ 2和Cγ 3具有同源性;Cυ 2是 IgY的樞紐區(qū),而它在IgY中沒有得到充分進(jìn)化。IgY中這種不發(fā)達(dá)的樞紐區(qū)造成了Fab部分的低活性,而這將可能是IgG與IgY某些差異的原因。與IgG一樣,IgY的Fc片段是絕大部分生物受動器功能的作用部位。IgYFc部分包括2條碳?xì)滏?而IgG只有1條。IgG在重鏈上含有3個功能域而IgY的重鏈含有4個功能域,而且IgY缺少鉸鏈區(qū)。

1.2 IgY進(jìn)入卵黃的機(jī)制 禽類的免疫系統(tǒng)包括細(xì)胞免疫和體液免疫,分別受胸腺和腔上囊的控制。當(dāng)機(jī)體受到外來抗原刺激后,腔上囊內(nèi)的B細(xì)胞分化成為漿細(xì)胞,分泌特異性抗體進(jìn)入血液循環(huán),當(dāng)血液流經(jīng)卵巢時,特異性抗體(主要是IgY)在卵細(xì)胞中逐漸蓄積。IgY通過受體調(diào)節(jié)作用,它只允許母源血液中存在的IgY選擇性地向卵黃轉(zhuǎn)移,轉(zhuǎn)運量與其在血清中的濃度相關(guān),該轉(zhuǎn)運對不同IgY的次級成分沒有差異性。當(dāng)卵細(xì)胞分泌進(jìn)入輸卵管時,流經(jīng)輸卵管的血液中含有的特異性抗體(主要是IgA和IgM)進(jìn)入卵清中,形成卵清抗體。Losc.H(1986)證實只有少量的IgA和IgM經(jīng)輸卵管從血細(xì)胞轉(zhuǎn)運到雞蛋白部分。

卵黃抗體作為一種新型綠色添加劑有其自身的優(yōu)勢:(1)卵黃抗體產(chǎn)量高,Anders(1993)推算認(rèn)為一只蛋雞每周的抗體產(chǎn)量相當(dāng)于9～10只小白兔的抗體產(chǎn)量。(2)雞蛋的生產(chǎn)成本較低,收集和提純方便,大規(guī)模提取抗體的技術(shù)已經(jīng)成熟。(3)產(chǎn)生有效免疫反應(yīng)所需抗原量小。(4)IgY的化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定,具有一定的耐熱、耐酸、耐堿及耐高滲性能,對胃蛋白酶具有良好的抵抗能力[2]。(5)由于種系發(fā)生距離相差很大,禽類IgY與哺乳動物免疫球蛋白之間不會發(fā)生交叉血清學(xué)反應(yīng)。(6)不激活哺乳動物的補(bǔ)體系統(tǒng),不與類風(fēng)濕因子或Fc受體相結(jié)合,避免在免疫檢測過程中產(chǎn)生假陰性或假陽性結(jié)果。(7)對腸道正常菌群無副作用,也不存在抗藥性和藥物殘留問題。IgY本身是一種優(yōu)質(zhì)的蛋白源,有促生長作用。

2 卵黃抗體在豬生產(chǎn)中的應(yīng)用

2.1 卵黃抗體在防治仔豬腹瀉上的應(yīng)用

2.1.1 仔豬大腸桿菌性腹瀉機(jī)制 仔豬大腸桿菌腹瀉是產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(ETEC)引起新生和斷奶仔豬腹瀉的主要致病菌之一[3]。大腸肝菌致病因子包括:粘附素(adhension)、腸毒素(enterotoxins)、水腫病毒素(edemadisease principle,EDP)、內(nèi)毒素(endotoxin)、溶血素(haemolysin)以及最近發(fā)現(xiàn)的EatA。其中ETEC引起仔豬腹瀉的主要致病原是具有宿主特異性的粘附素和腸毒素[4]。ET EC粘附素實質(zhì)上是一種菌毛蛋白又稱為定居因子(CFAS)。Conway(1990,1991)認(rèn)為與小腸黏膜上的受體結(jié)合是ETEC致病過程中的重要環(huán)節(jié)。仔豬的腸道黏膜上皮細(xì)胞表面具有多種能與 ETEC特異性粘附素結(jié)合的受體。ET EC宿主特異性菌毛粘附素有 20多種,引起仔豬腹瀉的主要是K88(F4)、K99(F5)、987P(F5)、F41等[5]。ETEC 菌毛抗原能夠識別特定受體并與之結(jié)合使菌體能夠抵抗腸道蠕動產(chǎn)生的沖刷作用從而定植下來,大量增殖并產(chǎn)生腸毒素(耐熱腸毒素、不耐熱腸毒素、志賀毒素2e、腸管凝集耐熱腸毒素)。耐熱腸毒素(ST)與神經(jīng)節(jié)苷脂(GM1)結(jié)合激活腸黏膜細(xì)胞表面的鳥苷環(huán)化酶(GC),使胞內(nèi)cGMP含量增多從而導(dǎo)致腹瀉;不耐熱腸毒素(LT)與GM1結(jié)合后激活腸上皮細(xì)胞的腺苷酸環(huán)化酶,使細(xì)胞中cAMP水平升高,進(jìn)而導(dǎo)致腸黏膜細(xì)胞對水和Na+、Cl-、HCO-3等過度分泌至腸腔引起腹瀉。

2.1.2 IgY抑制大腸桿菌菌毛粘附素與小腸黏膜受體結(jié)合的作用機(jī)制 IgY抑制大腸桿菌菌毛粘附素與小腸黏膜受體結(jié)合的作用機(jī)制可包括以下幾個方面:(1)特定病原菌卵黃抗體能直接粘附于病原菌的細(xì)胞壁上,改變病原細(xì)胞的完整性,直接抑制病原菌的生長。(2)卵黃抗體可粘附于細(xì)菌的菌毛上,使之不能粘附于腸道黏膜上皮細(xì)胞。(3)一部分卵黃抗體在腸道消化酶作用下,降解為可結(jié)合片段,這些片段含有抗體的可變小肽(Fab)部分,這些小肽很容易被腸道吸收,進(jìn)入血液后能與特定的病原菌粘附因子結(jié)合,使病原菌不能粘附易感細(xì)胞而失去致病性,而 IgY的穩(wěn)定區(qū)(Fc部分)留在腸內(nèi)。Jin(1998)用抗菌毛卵黃抗體處理后的大腸桿菌在體外與小腸上皮細(xì)胞的進(jìn)行吸附試驗,結(jié)果表明大腸桿菌在小腸黏液的吸附受到明顯的抑制。但試驗表明隨著E.coli濃度的提高,抑制效果明顯降低,說明lgY作用的發(fā)揮具有量依賴性。

Yokoyama H(1992)將提純的 ETEC的K88、K99、987P制成單價菌毛蛋白苗,免疫蛋雞獲得卵黃抗體粉末,ELISA 檢測結(jié)果表明,抗 K88、K99、987P的卵黃抗體能夠特異性地與相應(yīng)的菌毛抗原作用[6]。用卵黃抗體對不同ETEC菌株攻毒的新生仔豬進(jìn)行口服治療,治療組仔豬全部存活,而對照組仔豬死亡率超過80%[7]。高云英(2003)用ET EC的K88、K99、987P標(biāo)準(zhǔn)菌株和地方分離菌株制成多價菌體卵黃抗體經(jīng)預(yù)防、攻毒試驗及臨床治療效果觀察,對新生仔豬免疫保護(hù)率可達(dá)90%以上,3日齡仔豬攻毒保護(hù)率可達(dá)98%以上,3～11日齡仔豬臨床治愈率可達(dá)95%以上。

2.1.3 影響卵黃抗體防治仔豬腹瀉效果的因素(1)菌體與菌毛抗原。以菌體為抗原制備菌體疫苗,制作雖然方便但免疫效果不如菌毛抗原制備的菌毛蛋白苗效價高(肖馳等1998),試驗還顯示卵黃抗體對仔豬黃痢的治愈率高于慶大霉素、土霉素和痢特靈[8-9]。(2)卵黃抗體的劑量和 ETEC的濃度。小腸內(nèi)所含抗體須達(dá)到一定劑量才能阻止E.coli粘附到小腸黏膜上皮細(xì)胞的受體上。(3)采用卵黃抗體進(jìn)行治療應(yīng)具有連續(xù)性,例如:每只仔豬每天飼喂1.5 g的卵黃抗體能有效防治1010CFU/mL ET EC引起的腹瀉,在飼糧中添加0.2%卵黃抗體可預(yù)防商業(yè)性豬場中仔豬腹瀉。

2.1.4 卵黃抗體在豬腸道內(nèi)的變化規(guī)律 對于新生仔豬,卵黃抗體能在腸道內(nèi)能被有效吸收并被主動轉(zhuǎn)運至循環(huán)系統(tǒng),其吸收通道大約在出生后36 h關(guān)閉。卵黃抗體在血清中的半衰期大約只有1.85 d。抗體在0,3,6,21日齡的24 h內(nèi)都保持一定滴度,表現(xiàn)出卵黃抗體對胃酸和消化酶有良好的耐受性(Yokoyama H,1992)[6]。隨著仔豬日齡的增加,其消化系統(tǒng)逐步發(fā)育完善,使得胃酸pH降低和消化酶活性提高,卵黃抗體(IgY)分子在這種環(huán)境下結(jié)構(gòu)易被破壞而失去活性。結(jié)合許多飼養(yǎng)試驗結(jié)果,卵黃抗體在4～5周齡仔豬腸道內(nèi)仍能保持相當(dāng)高的穩(wěn)定性。因此,對于3～4周齡的斷奶仔豬,用卵黃抗體防治細(xì)菌感染能保證其有效性。

2.2 卵黃抗體在豬防治其他疾病中的應(yīng)用 劉湘新等(2004)采用豬鏈球菌活疫苗(ST17I株)免疫雞制作卵黃抗體,免疫效價達(dá)到1∶1024,血凝抑制效價為1∶1600,并且高免蛋可在7～30 d維持。

3 問題與展望

卵黃抗體有其自身優(yōu)勢,但I(xiàn)gY在生產(chǎn)中也存在不容忽視的問題:經(jīng)蛋垂直傳播疫病的病原,可能存在于卵黃抗體中,如減蛋綜合征、禽白血病、禽沙門菌病、雞慢性呼吸道病等;蛋黃中含有大量分子量很大的卵黃磷蛋白及脂肪等物質(zhì),注入肌肉難以吸收而造成局部腫脹、壞死和過敏反應(yīng)[10]。卵黃抗體粉是高蛋白物質(zhì),營養(yǎng)豐富,生產(chǎn)過程中極易污染細(xì)菌;隨著仔豬消化系統(tǒng)逐步發(fā)育完善,使得胃酸pH降低和消化酶活性提高,IgY的分子結(jié)構(gòu)易被破壞而部分失去活性。因此,需要進(jìn)一步研制開發(fā)IgY的有效保護(hù)劑;生產(chǎn)卵黃抗體還沒有規(guī)范的操作規(guī)程,也沒有用于監(jiān)測的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。應(yīng)盡快建立、完善和統(tǒng)一IgY的產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),以保證其產(chǎn)品質(zhì)量的可靠性。應(yīng)用抗生素容易導(dǎo)致藥物殘留和耐藥性;用疫苗免疫母豬,母源抗體含量高但持續(xù)時間短;口服高免動物血清成本較高[11]。IgY作為一種新型的綠色添加劑,具有安全、經(jīng)濟(jì)、高效的特點,符合人們對于安全綠色食品生產(chǎn)的要求,因此在生物制品的開發(fā)和疾病的防治方面具有廣闊的前景。多價卵黃抗體微生態(tài)制劑是多價卵黃抗體與益生菌兩種活性物質(zhì)有機(jī)組合的固體制劑,能充分發(fā)揮卵黃抗體的特異性免疫功能與益生菌的非特異性免疫及相應(yīng)生理促進(jìn)功能,達(dá)到預(yù)防和治療感染性疾病的作用,而且具有無污染、無抗藥性、無殘留、藥效持續(xù)時間長等特點,可有效替代抗生素,在畜牧保健領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景。

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