煙草基因組知識(shí)篇：2.基因組測(cè)序

孫玉合

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，青島 266101）

基因組計(jì)劃的最終目標(biāo)是獲取所研究生物體的全部DNA序列，一般包括三個(gè)圖譜，即遺傳圖譜、物理圖譜和基因組全序列圖譜，并將基因以及其他有意義的特征定位于DNA序列中。人以及模式生物的染色體都不能直接進(jìn)行DNA測(cè)序，因此首先必須將它們隨機(jī)地“敲碎”（通過(guò)限制性內(nèi)切酶酶切或超聲波處理或 DNA酶Ⅰ降解）變成成千上萬(wàn)的小片段，構(gòu)建成不同水平和類型的基因組文庫(kù)，例如 YAC（yeast artificial chromosome，酵母人工染色體）文庫(kù)、BAC（bacterial artificial chromosome，細(xì)菌人工染色體）文庫(kù)和cDNA文庫(kù)等。然后對(duì)文庫(kù)中的每個(gè)克隆片段進(jìn)行DNA測(cè)序，再對(duì)所有測(cè)定的每條序列經(jīng)過(guò)計(jì)算機(jī)程序處理裝配成染色體上完整的DNA序列。

1 DNA測(cè)序方法

兩種不同的快速有效的傳統(tǒng) DNA測(cè)序方法于上世紀(jì) 70年代中期幾乎同時(shí)發(fā)表。鏈終止法（chain termination method）指單鏈DNA分子的序列由互補(bǔ)的多核苷酸鏈的酶促合成來(lái)決定，互補(bǔ)鏈在特定的核苷酸位置終止[1]。化學(xué)降解法（chemical degradation method）指雙鏈DNA分子用化學(xué)物質(zhì)處理后，在特定核苷酸位置被切開(kāi)，從而確定 DNA分子的序列[2]。鏈終止法是基因組測(cè)序的主要方法，一方面因?yàn)榛瘜W(xué)降解法中的化學(xué)試劑有毒，對(duì)測(cè)序人員的健康有害，另一方面主要因?yàn)殒溄K止法更易自動(dòng)化[3]?；蚪M計(jì)劃包括大量的測(cè)序反應(yīng)，手工測(cè)序?qū)⒒ㄙM(fèi)很多年時(shí)間，因此要在可接受的時(shí)間內(nèi)完成測(cè)序計(jì)劃，就必須采用自動(dòng)測(cè)序方法。

自上世紀(jì)90年代初，所有的DNA測(cè)序操作幾乎無(wú)一例外地全部采用半自動(dòng)化毛細(xì)管電泳鏈終止測(cè)序法。為了提高測(cè)序速度，人們嘗試設(shè)計(jì)新的測(cè)序方法，其中一種就是焦磷酸測(cè)序（pyrosequencing），它不需要電泳或其他方法分離不同長(zhǎng)度片段，因此比鏈終止法測(cè)序速度快[4]。最近，許多新一代測(cè)序儀（例如美國(guó)Roche Applied Science公司的454基因組測(cè)序儀、美國(guó)Illumina公司和英國(guó)Solexa technology公司合作開(kāi)發(fā)的Illumina測(cè)序儀又稱作Solexa測(cè)序儀、美國(guó)Applied Biosystems公司的SOLiD測(cè)序儀等）都使用了一種稱之為循環(huán)芯片測(cè)序法（cyclic-array sequencing）的新方法，也可將其稱為“新一代測(cè)序技術(shù)或者第二代測(cè)序技術(shù)”[5]。所謂循環(huán)芯片測(cè)序法，簡(jiǎn)言之就是對(duì)布滿DNA樣品的芯片重復(fù)進(jìn)行基于DNA的聚合酶反應(yīng)以及熒光序列讀取反應(yīng)。新型納米孔測(cè)序法（nanopore sequencing）是采用電泳技術(shù)，借助電泳驅(qū)動(dòng)單個(gè)分子逐一通過(guò)納米孔來(lái)實(shí)現(xiàn)測(cè)序的，它可以價(jià)廉、快速地進(jìn)行DNA測(cè)序，它有望成為第三代測(cè)序技術(shù)（也可稱為下下一代測(cè)序技術(shù)）[6-7]。

2 DNA測(cè)序的策略

基因組測(cè)序工作量浩大，選擇適當(dāng)?shù)臏y(cè)序策略很重要。測(cè)序策略主要有兩種：第一種是克隆重疊群作圖（clone contig mapping），也稱“自上而下”作圖（top-down mapping）或由長(zhǎng)到短作圖策略；第二種是“全基因組鳥(niǎo)槍法”（whole-genome shotgun method）作圖，也稱“自下而上”作圖（bottom-up approach/mapping）或由短到長(zhǎng)作圖策略[8]。這兩種測(cè)序策略也稱作完全測(cè)序和草圖型測(cè)序策略[9]。

在第一種測(cè)序策略中，首先建立連續(xù)克隆重疊群，再對(duì)單個(gè)重疊群采用鳥(niǎo)槍法進(jìn)行逐個(gè)測(cè)序，最后在重疊群內(nèi)進(jìn)行拼接，獲得全長(zhǎng)序列。而在第二種測(cè)序策略中，直接將基因組DNA隨機(jī)切成2 kb（kilobase，千堿基）左右的小片段，然后進(jìn)行隨機(jī)末端測(cè)序，再以基因組的分子標(biāo)記為起點(diǎn)進(jìn)行DNA片段拼接，計(jì)算機(jī)分析串聯(lián)得到全序列。序列拼接的最初結(jié)果是一系列的骨架序列（scaffold），每條骨架序列包括一系列被序列缺口分開(kāi)的連續(xù)序列，不同的骨架序列之間被物理缺口分開(kāi)；通過(guò)封閉序列缺口和物理缺口，可將不同的骨架序列拼接起來(lái)。

3 DNA序列的裝配

無(wú)論是采用哪種策略進(jìn)行測(cè)序，得到的都是成百上千萬(wàn)的小片段DNA序列，最后必須要將它們裝配成基因組每條染色體上真實(shí)的排列順序，這是手工操作無(wú)法完成的，需要借助計(jì)算機(jī)和數(shù)據(jù)庫(kù)以及相關(guān)的軟件系統(tǒng)。因此，DNA序列的裝配是一項(xiàng)浩繁、技術(shù)要求高而又精細(xì)的工作。

首先需要通過(guò)計(jì)算機(jī)軟件對(duì)測(cè)定的DNA序列的數(shù)據(jù)質(zhì)量和準(zhǔn)確性進(jìn)行評(píng)估，包括給出每個(gè)堿基的可信度；確定所測(cè)每個(gè)樣品的高質(zhì)量部分；在序列拼接完成后對(duì)拼接成的重疊群整體的可信度進(jìn)行評(píng)估，給出可能的錯(cuò)誤率[8]。其次，進(jìn)行序列裝配。一般采用的是Phil Green實(shí)驗(yàn)室建立和發(fā)展的Phred-Phrap-Consed軟件系統(tǒng)。不過(guò)，隨著基因組計(jì)劃的不斷進(jìn)行，各國(guó)各實(shí)驗(yàn)室都開(kāi)發(fā)和建立了自己的基因組測(cè)序裝配的相關(guān)軟件。

基因組測(cè)序的最后一步是基因組注釋（genome annotation），即利用生物信息學(xué)方法和工具，對(duì)基因組所有基因的生物學(xué)功能進(jìn)行高通量注釋，包括基因識(shí)別和基因功能注釋（這將在下期中介紹）。

人類基因組計(jì)劃（HGP）于1990年正式啟動(dòng)。2001年，“國(guó)際人類基因組測(cè)序聯(lián)合體”（International Human Genome Sequencing Consortium, IHGSC）和美國(guó)Celera Genomics公司幾乎同時(shí)在《自然》和《科學(xué)》雜志上刊文發(fā)表了兩個(gè)人類基因組序列的“工作框架圖”，它們覆蓋了97%的基因組，組裝了85%的基因組序列[10-11]。在對(duì)人類基因組的測(cè)序與序列裝配過(guò)程中，IHGSC和Celera Genomics公司采用了不同的方法。IHGSC采用的是克隆重疊群法，也稱為層次鳥(niǎo)槍測(cè)序法（hierarchical shotgun sequencing），而Celera Genomics公司采用的則是全基因組鳥(niǎo)槍測(cè)序法，也稱為隨機(jī)全基因組測(cè)序法（random whole-genome sequencing）。2004年，IHGSC在《自然》上發(fā)表了人類基因組全序列的測(cè)定結(jié)果[12]，人類基因組接近完整的序列圖包含28億5千萬(wàn)個(gè)堿基對(duì)，覆蓋了常染色質(zhì)99%的序列，在10萬(wàn)個(gè)堿基中誤差率只有一個(gè)堿基，特別值得注意的是人類基因組僅有2～2.5萬(wàn)個(gè)編碼蛋白質(zhì)的基因。

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