枯草芽孢桿菌SH7抑菌蛋白產(chǎn)生的最佳發(fā)酵條件及溫室防效

張秀玉 ，孔凡玉，王 靜，張成省，李佰樂 ，楊 斌，管志坤，王秀萍

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，青島 266101；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京 100081；3.山東青島煙草有限公司，青島 266071；4.山東青島煙草有限公司膠南分公司，山東 膠南 266400)

枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)是一種嗜溫的好氧性產(chǎn)芽孢桿狀細菌(G+)，具有廣泛的抗菌活性和極強的抗逆能力，易于商業(yè)化，因此一直是植病生物防治領(lǐng)域的研究熱點[1-5]，其中一些優(yōu)良菌株已被應(yīng)用于生產(chǎn)[6-7]。Bacillus subtilis 在生長代謝中主要產(chǎn)生抗蛋白的最適培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件進行了初步探討。生素和抗菌蛋白等拮抗物質(zhì)[8-9]。

從煙草根際土壤分離到一株對煙草青枯病菌(Ralstonia solanacearum)有較強拮抗作用的生防細菌SH7，經(jīng)細菌常規(guī)及16s rDNA鑒定為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，其無菌發(fā)酵液對煙草青枯病的溫室盆栽試驗防效較好，并初步證明了該菌產(chǎn)生的拮抗物質(zhì)為蛋白類物質(zhì)[10]。筆者對SH7菌株拮抗蛋白的最適培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件進行了初步探討。

1 材料與方法

1.1 材料

指示菌為煙草青枯病菌(Ralstonia solanacearum)，拮抗菌為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)SH7菌株，均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所植物病理學(xué)實驗室分離純化。

1.2 方法

1.2.1 最佳培養(yǎng)基篩選 拮抗菌SH7菌株最適液體培養(yǎng)基從NA，ATCC，LB，BPY，TYG等[11]中篩選。pH7.0，28 ℃，150 r/min，振蕩培養(yǎng)48 h；以菌體生長量，抗菌蛋白含量及其抑制青枯病菌的活性為指標，確定菌株產(chǎn)抗菌蛋白的最佳培養(yǎng)基。每組試驗重復(fù)3次.

1.2.2 菌體生長量測定 將培養(yǎng)完后的菌體培養(yǎng)液稀釋成不同的濃度梯度，吸取100 μL均勻涂布在NA固體培養(yǎng)基上，28 ℃下培養(yǎng)24 h；觀察菌體狀況和測量菌落數(shù)，計算出菌體生長量。每組實驗重復(fù)3次。

1.2.3 抗菌蛋白粗提取 培養(yǎng)液于8000 r/min離心10 min去菌體，取100 mL上清液，冰浴、攪拌緩慢滴加硫酸銨，直到上清液達到90%的硫酸銨飽和度，4 ℃靜置過夜；12000 r/min 4 ℃離心10 min取沉淀，沉淀用0.02 mol/LTris-HCL緩沖液(pH7.2)溶解，置于透析袋(截留相對分子質(zhì)量3500)中，用同濃度的緩沖液透析去鹽即得到抗菌蛋白粗提液，檢測抑菌活性。蛋白質(zhì)的濃度測定按照文獻[12]。

1.2.4 抗菌活性測定 采用牛津杯擴散法法。將指示菌煙草青枯病菌懸液加入50 ℃ NA固體培養(yǎng)基中倒平板，將待測的活性物質(zhì)注入孔內(nèi)，每個牛津杯注入150 μL，28 ℃下培養(yǎng)24 h，以不接種SH7菌株的相同培養(yǎng)基按1.2.2方法提取蛋白作空白對照，觀察抑菌狀況并測量抑菌圈大小。

1.2.5 培養(yǎng)條件的優(yōu)化 以最佳培養(yǎng)基和篩選培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件為基礎(chǔ)，通過分別改變培養(yǎng)基的初始pH(4, 5, 6, 7, 8, 9, 10)、裝液量(250 mL三角瓶每瓶裝50, 75, 100, 125, 150, 175 mL)、培養(yǎng)溫度(22, 24,26, 28, 30, 32, 34, 36 ℃)、培養(yǎng)時間(12, 24, 36, 48,60, 72, 84, 96, 108 h)和搖床轉(zhuǎn)速(130, 150, 170, 190,210, 230 r/min)，按方法1.2.2測菌體生長量，按方法1.2.3 提取抗菌蛋白并檢測其濃度，按1.2.4方法檢測抑菌活性；以菌體生長量、抗菌蛋白含量及其抑制青枯病菌的活性為指標，來確定該菌種產(chǎn)抗菌蛋白的最佳培養(yǎng)條件。每組試驗重復(fù)3次。

1.2.6 抗菌蛋白粗提物特性測定 用pH為2, 3, 4, 5,6, 7, 8, 9, 10的鄰苯二甲酸氫鉀、磷酸氫二鈉-檸檬酸、Tris-CL及硼砂緩沖液代替水，將粗提拮抗蛋白分別調(diào)至不同pH；將抗菌蛋白粗液分別于20, 40, 60,80, 100, 121 ℃處理20 min；分別按1.2.3方法檢測抑菌活性，每孔加入150 μL的處理液，以未經(jīng)處理抗菌蛋白粗液作對照，24 h后觀察抑菌狀況和測量抑菌圈大小。

1.2.7 室內(nèi)防效測定 待煙草(NC89)株高為20 cm時，設(shè)2個處理：1)同時注射抗菌蛋白粗提液和煙草青枯病菌；2)注射煙草青枯病菌為空白對照。在煙草第2片真葉的葉腋處將菌液注射到莖內(nèi)維管束部位，抗菌蛋白粗提液質(zhì)量濃度0.10 mg/mL，菌液濃度均為1×108cfu/mL，每株煙草注射0.5 mL，每處理30株煙草。于注射煙草青枯病菌后第30天調(diào)查發(fā)病情況。

2 結(jié) 果

2.1 培養(yǎng)條件對SH7菌株及其抗菌蛋白的影響

2.1.1 培養(yǎng)基種類 不同液體培養(yǎng)基對SH7菌株產(chǎn)抗菌蛋白量及其抑菌活性、菌株生長的影響如表1。NA培養(yǎng)基可產(chǎn)較多抗菌蛋白且活性相對較高，抑菌圈直徑達22.4 mm，蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度達0.116 mg/mL，同時NA培養(yǎng)基也利于菌體的生長，菌體量為8.0×108cfu /mL，所以NA培養(yǎng)基最適宜于SH7菌株生長和產(chǎn)抑菌蛋白。

表1 培養(yǎng)基對抑菌活性、抗菌蛋白產(chǎn)量及菌體生長的影響Table1 Effects of medium on inhibition ability, antagonistic protein of SH7 and its growth

2.1.2 起始pH 由表2可看出，SH7在中性及堿性環(huán)境中生長，能產(chǎn)生抑菌蛋白，而在中性環(huán)境對菌體的生長、抗菌蛋白的產(chǎn)生及積累最為有利。在pH6.0時，產(chǎn)生較多的抗菌活性物質(zhì)，抗菌蛋白相對含量較高，表現(xiàn)的抑菌活性最強，抑菌圈直徑為23.1 mm，蛋白質(zhì)含量為0.162 mg/mL，菌體量為6.3×108cfu /mL，故pH6.0最適。

表2 pH對抑菌活性、抗菌蛋白產(chǎn)量及菌體生長的影響Table2 Effects of different pH on inhibition ability,antagonistic protein of SH7and its growth

2.1.3 裝液量 從表3得知，SH7在不同的裝液量下均能生長且產(chǎn)生抗菌蛋白，但裝液量過多或過少均不利于菌體的生長，從而影響抗菌蛋白的產(chǎn)生。裝液量100 mL時菌體生長量、抗菌蛋白含量和抑菌活性最高，菌體量為5.8×109cfu/mL，抑菌圈直徑達21.7 mm，蛋白質(zhì)含量為0.148 mg/mL，裝液量100 mL為最適。

表3 裝液量對抑菌活性、抗菌蛋白產(chǎn)量及菌體生長的影響Table3 Effects of medium volume on inhibition ability,antagonistic protein of SH7 and its growth

2.1.4 培養(yǎng)溫度 從表4得知，在26 ℃和28 ℃時，菌體生長量和產(chǎn)生蛋白量相差很少，而26 ℃時抑菌活性遠遠比28 ℃時高，即產(chǎn)生的抑菌活性物質(zhì)較多，抑菌圈直徑達17.6 mm，故最適溫度為26 ℃。

2.1.5 培養(yǎng)時間 從表5得知，在一定時間范圍內(nèi)，隨著培養(yǎng)時間的增加，菌體的增長量與蛋白的產(chǎn)生量呈正比關(guān)系。96 h時菌體生長量和蛋白含量達到最大值，分別為：2.3×1011cfu/mL, 0.214 mg/mL。且在96 h時抑菌圈直徑最大為21.6 mm，即此時具有活性的抑菌蛋白含量最多，故96 h為最佳培養(yǎng)時間。

表4 培養(yǎng)溫度對抑菌活性、抗菌蛋白產(chǎn)量及菌體生長的影響Table4 Influence of culture temperature on inhibition ability,antagonistic protein of SH7 and its growth

表5 培養(yǎng)時間對抑菌活性、抗菌蛋白產(chǎn)量及菌體生長的影響Table5 Influence of culture time on inhibition ability,antagonistic protein of SH7 and its growth

2.1.6 轉(zhuǎn)速 不同轉(zhuǎn)速下，菌體生長的通氣量不同，從而影響菌體的生長。從表6可知，在170 r/min時蛋白含量和菌體生長量均達到最大值，分別為：0.159 mg/mL, 8.7×109cfu/mL，此時抑菌圈直徑也最大為18.8 mm，故170 r/min為最佳培養(yǎng)轉(zhuǎn)速。

2.2 抗菌蛋白粗提物特性

抑菌蛋白粗提液經(jīng)20～60 ℃處理20 min后抑菌活性基本保持不變，80 ℃處理20 min后抑菌活性稍微下降，100 ℃和121 ℃處理20 min后分別保持抑菌活性的83.1%和68.0%，說明該抑菌蛋白的熱穩(wěn)定性較好。

常溫(28 ℃)下測定得，在pH中性及偏堿性范圍內(nèi)，抗菌蛋白粗提液保持大部分抑菌活性，而在酸性環(huán)境中基本沒有抑菌活性。pH為2.0, 3.0, 4.0時其抑菌活性接近 0；pH5.0時其抑菌活性仍保持32%；pH6.0和7.0時其抑菌活性仍保持100%；pH8.0,9.0, 10.0時其抑菌活性分別為89%, 86%, 88%，說明該抑菌蛋白的中性及堿穩(wěn)定性比較好。

2.3 室內(nèi)防效效果

注射抗菌蛋白粗提液對煙草青枯病能起到較好的防治效果，防效達70.8%，其發(fā)病率為29.2%；空白對照發(fā)病率為92.10%。

3 討 論

本實驗室分離的SH7是一株枯草芽孢桿菌，實驗證實SH7菌株對煙草具有促生作用，對其他作物青枯病菌、煙草黑脛病和煙草赤星病菌具有良好的拮抗作用，且已分離純化出具有抑菌活性的蛋白，其分子量是33.6 kD(另文報道)。本次實驗用充分鹽析后的硫酸銨沉淀物進行一系列的溫度處理，在20～60 ℃處理 20 min后活性基本保持不變，100℃和121 ℃處理20 min后分別仍保持抑菌活性的83.1%, 68.0%；該抑菌蛋白在pH為9.0, 10.0時其抑菌活性仍分別為86%, 88%，說明對熱、堿性條件穩(wěn)定，可與一些堿性藥劑一起施用。從最佳培養(yǎng)時間的篩選中可以看出，在一定時間范圍中，隨著培養(yǎng)時間的增加，蛋白含量與菌體生長量成正比。

[1]陳中義，張杰，黃大昉.植物病害生防芽孢桿菌抗菌機制與遺傳改良研究[J].植物病理學(xué)報，2003，33(2):97-103.

[2]陳志誼，高太東，嚴大富，等.枯草芽孢桿菌 B2916防治水稻紋枯病的田間試驗[J].中國生物防治，1997，13(2)：75-78.

[3]Sturz A V, Christie B R, Nowak J.Bacterial endophytes:Potential role in developing sustainable systems of crop production [J].Critical Reviews in Plant Sciences, 2000,19(1): 1-30.

[4]Raupach G S, Kloepper J W.Mixtures of plant growthpromoting rhizobacteria enhance biological control of multiple cucumber pathogens [J].Photopathology, 1998,88(11): 1158-1164.

[5]隋文志，丁麗俐，吳魁斌.枯草芽孢桿菌 HB248防病增產(chǎn)效果研究[J].現(xiàn)代化農(nóng)業(yè), 1995(3):4-5.

[6]Baker K F.Evolving concepts of biological control of plant pathogens [J].Ann Rev Phytopathol, 1987, 25:67-85.

[7]Asaka O，Shoda M.Biocontrol of Rhizoctonia solani damping-off of tomato with Baccilus subtilis RB14 [J].App1 Environ Microbiol, 1996, 62 (11): 4081-4085

[8]Moyne A-L, Cleveland T E, Tuzun S.Molecular characterization and analysis of the operon encoding the antifungal lipopeptide bacillomycin D [J].FEMS Microbiology Letters, 2004, 234: 43-49.

[9]Ahimou F, Jacques P, Deleu M.Surfactin and iturin A effects on Bacillus subtilis surface hydrophobicity [J].Enzyme and Microbial Technology, 2000, 27: 749-754.

[10]王靜, 趙廷昌，孔凡玉，等.SH7對煙草青枯病的抑菌、防病作用及其抑菌物質(zhì)的初步研究[J].中國煙草科學(xué)2007，28(2): 41-44.

[11]中國微生物菌種保藏委員會.中國菌種目錄[M].北京：輕工業(yè)出版社，1983: 404-422.

[12]Bradford M M.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J].Analytical Biochemistry, 1976, 72: 248-254.