狐貍源維里納氣單胞菌的分離鑒定

劉 燕,應月青,趙 京,張成林,閻 鶴

(1.北京動物園,北京 西城 100044;2.北京市產品質量監(jiān)督檢驗所,北京朝陽 100026)

氣單胞菌屬為水中常居菌,是水生生態(tài)系統(tǒng)中重要的病原菌,致病范圍廣泛,可引起多種水產動物感染發(fā)病[1]。該屬主要有嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)、豚鼠氣單胞菌(Aeromonas caviae)、維里納氣單胞菌(Aeromonas veronii)等。相比該屬中的其他細菌,維里納氣單胞菌報道相對少些。2009年9月中旬,我園多只狐貍相繼出現(xiàn)土灰色稀軟便,精神沉郁,不愛運動,無食欲的癥狀。其中兩只銀狐和一只白狐出現(xiàn)癥狀一天就死亡,其他經治療后恢復。取死亡狐貍心血和肝臟,經病原菌檢驗,分離到一株維里納氣單胞菌,該菌株毒力較強判定為致病菌。具體情況報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 本園圈養(yǎng)的兩只銀狐和1只白狐;所用儀器包括立式高壓蒸汽滅菌鍋、光學顯微鏡、冰箱、超凈工作臺、恒溫培養(yǎng)箱等;有氧血培養(yǎng)瓶和API細菌鑒定系統(tǒng)試劑條均購于法國梅里埃生物有限公司;脫纖維羊血、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基等均購于北京陸橋生物技術有限公司;我園自養(yǎng)健康小鼠,體重均約25 g左右。

1.2 分離培養(yǎng) 分別取死亡狐貍心血和肝臟,對血液涂片進行姬姆薩染色,對肝臟組織觸片進行革蘭染色。同時,將血液接種于有氧血培養(yǎng)瓶,于37℃條件下培養(yǎng)24～48 h;肝臟組織接種于血液瓊脂培養(yǎng)基,分別置于有氧和厭氧兩種環(huán)境下,于37℃條件下培養(yǎng)24～48 h。

1.3 形態(tài)學觀察 對培養(yǎng)出的細菌菌落進行觀察,記錄其特征;純培養(yǎng)物經革蘭染色后,觀察細菌的個體形態(tài)及染色特征;用懸滴法在暗視野下觀察細菌的運動性。

1.4 生化特性鑒定[2]挑取純化的細菌的單個菌落分別做氧化酶、觸酶、糖發(fā)酵等試驗,鑒定其生物學特性。

1.5 半自動鑒定系統(tǒng)鑒定 根據(jù)染色結果、氧化酶和觸酶試驗結果,選擇合適的法國梅里埃公司API細菌鑒定系統(tǒng)試劑條進行鑒定。

1.6 致病性 分離純化的菌株,采用普通瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h,用無菌0.85%生理鹽水沖洗菌苔,參照麥氏比濁法測定菌液濃度后稀釋至一定濃度,腹腔注射健康25 g體重小鼠測定其致病力。

2 試驗結果

2.1 死亡狐貍臨床癥狀及病理剖檢變化 3只狐貍在發(fā)病癥狀、剖檢病理變化和病理切片等方面都表現(xiàn)出很高的相似性。具體如下:發(fā)病癥狀為土灰色稀軟便,有時便中帶血,精神沉郁,不愛運動,無食欲,死亡時肛門有出血;剖檢病理變化為腸道積氣,小腸段漿膜出血明顯,胃腸空虛,胃幽門區(qū)有出血斑,心肌有出血點,切面內膜出血點,肺出血斑點,左肺大面積突變,腎盂部出血,肝表面顏色不均,局部壞死;病理組織切片病變?yōu)樾募〖毎罅堪l(fā)生壞死,萎縮,肝臟有細菌團塊,脾臟有較多的局灶性淋巴細胞增多,肺淤血較嚴重,有淋巴細胞浸潤,肺泡塌陷。

2.2 分離培養(yǎng)結果 肝臟組織觸片見到陰性小桿菌,血涂片經姬姆薩染色見到紫色小桿菌。厭氧培養(yǎng)未分離到細菌。血液和肝臟于有氧條件下均分離到一株較純細菌。該株細菌革蘭染色陰性,桿狀(有的稍彎曲),也有接近球狀,兩端鈍圓,無芽孢,單個、成雙或短鏈 ,大小多在 0.3 ～0.7 μ m ×1.2～ 2.5 μ m的細菌。該細菌有運動性。在普通營養(yǎng)瓊脂上其菌落特征為圓形光滑、邊緣整齊、灰白色、不透明,培養(yǎng)24 h菌落直徑多在1.2 mm左右(稍隆起),48 h多在1.8 mm左右(較扁平),生長豐盛;在血瓊脂培養(yǎng)基上的菌落圓形光滑、邊緣整齊、稍隆起、近乳白色、β-溶血,亦生長豐盛。

2.3 生化試驗結果 氧化酶(+),觸酶(+),阿拉伯糖產酸(-),乳糖產酸(-),麥芽糖產酸(+),半乳糖產酸(+),棉籽糖(-),吲哚(+),V-P反應(+),七葉苷水解(+),H2S產生(-),水解尿素(-),丙二酸利用(-),硝酸鹽還原(+),ONPG(+)。根據(jù)該生化試驗結果判定為維里納氣單胞菌。

2.4 API鑒定系統(tǒng)鑒定結果 本菌株為氧化酶陽性、觸酶陽性的陰性小桿菌,選擇API20E鑒定試紙條進行鑒定。鑒定結果為嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila),鑒定率為80%。

2.5 致病性試驗結果 將該菌株24 h培養(yǎng)物稀釋至一個麥氏單位,腹腔注射體重為20～30 g的小鼠,對照注射普通肉湯。設置0.25 mL、0.5 mL、1 mL 3種注射量(因小鼠數(shù)量有限,每種注射量各注射1只小鼠)。結果除對照外其他小鼠均于6 h內死亡。并從死亡小鼠的心血中分離到較純的維里納氣單胞菌。說明該菌是小鼠死亡的致病菌株。

3 結果與討論

API鑒定系統(tǒng)鑒定結果和生化試驗鑒定結果不完全符合,而且鑒定百分率也只有80%。分析原因是因為本試驗使用的API鑒定系統(tǒng)的數(shù)據(jù)庫中不包含維里納氣單胞菌。根據(jù)生化試驗結果,認定該菌株應為維里納氣單胞菌(Aeromonas veronii)。動物試驗結果表明,該菌株毒力很強,可以肯定為這次狐貍發(fā)病甚至導致死亡的病原菌。該菌株已申請保存于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所附屬的中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心。

維里納氣單胞菌是于1983年為紀念法國微生物學家Véron而命名的新種。該菌主要引起水產動物致病,如斑點叉尾鮰、錦鯉、泥鰍、中華絨螯蟹[3]等等,是水中的常居致病菌。對非水產動物以及人類致病主要通過飲水、食用魚類或傷口接觸水被感染等發(fā)生?？梢砸饎游锘蛉耸澄镏卸綶4]、水源性腸道疾病以及死亡等等。預防該菌屬的流行主要通過加強飲水、食品衛(wèi)生來控制。

[1]周庭銀.臨床微生物學診斷與圖解[M].上海:上?？茖W技術出版社,2007:193-195.

[2]東秀珠,蔡妙英.常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊[M].北京:科學出版社,2001:117-119.

[3]房海,陳翠珍,張曉君,等.中華絨螯蟹病原維氏氣單胞菌的檢驗[J].中國人獸共患病學報,2008,24(1):45-49.

[4]楊守明,幾起嗜水氣單胞菌引起的食物中毒流行病學特征分析[J].中華疾病控制雜志,2009,13(2):206-207.