雞Toll樣受體的研究進(jìn)展

韓小鳳,張輝華,謝青梅,馬靜云,畢英佐

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)院,廣東 廣州 510642;2.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)院,廣東 佛山 528231)

Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)是一種天然免疫分子,它通過識(shí)別病原體相關(guān)分子模式(pathogen associated molecular pattern,PAMP)在其宿主有機(jī)體的天然免疫系統(tǒng)中起著重要的防御作用[1]。它的結(jié)構(gòu)包括以下3個(gè)部分：胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)。胞外區(qū)富含亮氨酸重復(fù)序列(leuine-rich repeats,LRRs),跨膜區(qū)富含半胱氨酸,胞內(nèi)區(qū)有一個(gè)高度保守的蛋白相互作用區(qū),與IL-1R(哺乳類白介素-1受體)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)區(qū)相似,稱為 Toll-IL-1R(TIR)功能域,亦稱為Toll同源結(jié)構(gòu)域(tollhomolo gydomain,THdomain),參與TLR的信號(hào)傳導(dǎo)[2]。目前研究表明,Toll樣受體家族成員具有不同的配體,表達(dá)方式也可能存在差異。它們識(shí)別不同的病原微生物組分,例如：脂蛋白、肽聚糖、雙鏈病毒RNA、LPS、咪唑喹啉(imidazoquinolines)、未甲基化細(xì)菌CpG-DNA等[3]。TLRs在激活免疫系統(tǒng)尤其是天然免疫系統(tǒng)中起著至關(guān)重要的作用。

至今,在哺乳動(dòng)物尤其是在人類和小鼠的細(xì)胞中,已發(fā)現(xiàn)13種TLRs[4],但禽類TLRs的研究才剛剛起步。Yilmaz A[5]等利用生物信息學(xué)中基因預(yù)測(cè)原理和ESTs數(shù)據(jù)信息,預(yù)測(cè)和鑒定出雞的TLRs同系物,分別稱為：ChTLR1LA,ChTLR1LB,ChTLR2A,ChTLR2B,ChTLR3,ChTLR4,ChTLR5,ChTLR7,之后不同實(shí)驗(yàn)室在研究中又陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了ChTLR15、ChTLR16、ChTLR21。與哺乳動(dòng)物 相比,所有ChTLRs都含有與其相同的蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu),包括若干富亮氨酸域,一個(gè)跨膜域和 IL-1R。本文就雞Toll樣受體的最新研究進(jìn)展進(jìn)行簡(jiǎn)要綜述,主要包括雞Toll樣受體的基因結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、功能特點(diǎn)及其細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制等方面內(nèi)容,為雞抗病藥物的開發(fā)和疾病的治療提供理論基礎(chǔ)。

1 ChTLRs的基因定位與基因結(jié)構(gòu)

基因組序列分析證明,Ch TLRs所處的染色體位置是比較保守的。ChTLR1LA和Ch TLR1LB的基因相連,定位于 4號(hào)染色體[1]。ChTLR2A和ChTLR2B也存在相同情況。Boyd Y等[6]進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)Ch TLR3基因定位于4號(hào)染色體,而ChTLR2更確切地是定位于 4號(hào)染色體 p11-q11區(qū)域。ChTLR2與ChTLR3相比,長(zhǎng)度大約少了4 100萬個(gè)核苷酸。作為人類的直系同源物,ChTLR4,ChTLR5和ChTLR7則不相連,分別定位于17、3號(hào)染色體和1號(hào)染色體。其中Ch TLR4準(zhǔn)確定位于小染色體E41W17區(qū)域,這個(gè)區(qū)域被證明與抗沙門菌感染有關(guān)[7]。另外,Nicholas D T等[1]最新證明Ch TLR15定位于3號(hào)染色體,ChTLR21定位于11號(hào)染色體。準(zhǔn)確掌握Ch TLRs的基因定位及結(jié)構(gòu)特點(diǎn),將為進(jìn)一步研究Ch TLRs相關(guān)機(jī)理提供一個(gè)新的切入點(diǎn)。

2 ChTLRs的幾種主要成員及功能

2.1 ChTLR3 Ch TLR3編碼一個(gè)含有896個(gè)氨基酸的蛋白,它能專一的識(shí)別雙鏈RNA(dsRNA),dsRNA是一種與病毒感染相關(guān)的分子,大部分病毒在復(fù)制的過程中產(chǎn)生dsRNA。此外,ChTLR3也能識(shí)別poly(I∶C)(一種dsRNA模擬物,具有病毒dsRNA相似的功能)。TLR3通過依賴My D88信號(hào)通路和非依賴My D88信號(hào)通路都能最終激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo),誘導(dǎo)NF-κB活化和各種細(xì)胞因子的表達(dá),調(diào)節(jié)機(jī)體細(xì)胞先天性免疫反應(yīng)。TLR3在病毒感染中起著重要的作用,它可以誘導(dǎo)干擾素(IFNs)和多種抗病毒效應(yīng)分子的產(chǎn)生。poly(I∶C)刺激雞的白細(xì)胞后,會(huì)誘導(dǎo)I型IFN和TLR3表達(dá)量的增加,同時(shí)Ⅰ型IFN也會(huì)刺激 TLR3的表達(dá)。Adam J等[8]用高致病性禽流感(H 5N1)病毒感染雞,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在雞的大腦、脾和肺組織中 TLR3和IFN表達(dá)上調(diào)。施蕾[4]通過用IBDV感染CEF,研究相關(guān) TLR對(duì) IBDV感染力的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)TLR3在病毒感染24 h后表達(dá)水平有明顯增高,從轉(zhuǎn)錄水平上證明了TLR3對(duì)IBDV感染有作用。同時(shí)試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)TLR3基因的沉默可影響IBDV的復(fù)制及成熟病毒的釋放,從翻譯水平上證實(shí)了 TLR3在IBDV的感染中起了重要的作用。

2.2 ChTLR4 Ch TLR4編碼一個(gè)含有843個(gè)氨基酸的蛋白,ChTLR4蛋白和人TLR4蛋白相比,有46%的同源性。Leveque G等[7]通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TLR4在雞組織中的表達(dá)水平大致相同,包括大腦、胸腺、腎臟、腸、肌肉、肝臟、肺、腔上囊,心臟和脾臟。利用連鎖分析可知,TLR4可以抵抗腸沙門菌對(duì)雞的感染,在雞的抗沙門菌宿主免疫中起著重要的作用。Jessica R等[9]最新研究發(fā)現(xiàn),用腸炎沙門菌分別刺激抗性雞群和易感雞群,兩組雞的異嗜白細(xì)胞TLR4 mRNA表達(dá)量有上調(diào)的趨勢(shì),說明家禽對(duì)沙門菌的易感性確實(shí)與Ch TLR4有關(guān)。

2.3 ChTLR5 ChTLR5全基因長(zhǎng)為2 589 bp,編碼一個(gè)含有862個(gè)氨基酸的蛋白。目前,Marijke K等[10]已克隆出雞TLR5的基因,并成功地把它表達(dá)到HeLa細(xì)胞中。他們用腸炎沙門菌感染ChTLR5轉(zhuǎn)染細(xì)胞可引起NF-κB的活化。ChTLR5可以識(shí)別腸炎沙門菌鞭毛蛋白并對(duì)其產(chǎn)生免疫應(yīng)答。同時(shí)研究也發(fā)現(xiàn)替換細(xì)菌鞭毛蛋白中單一的氨基酸可以改變TLR5的特殊應(yīng)答性,從而影響宿主感染的敏感度及范圍。無鞭毛的腸炎沙門菌會(huì)引起家禽產(chǎn)生系統(tǒng)性疾病,而有鞭毛的腸炎沙門菌則不會(huì)。鞭毛蛋白會(huì)導(dǎo)致雞對(duì)腸炎沙門菌的固有免疫應(yīng)答作用增強(qiáng),表明Ch TLR5在細(xì)菌感染過程中起著非常重要的作用。

2.4 ChTLR7 ChTLR7定位在1號(hào)染色體lq14-lq31,ChTLR7基因編碼1 059個(gè)氨基酸,包含2個(gè)外顯子。ChTLR7識(shí)別病毒單鏈RNA,這種識(shí)別會(huì)誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子例如IL-1β和IL-6以及抗病毒細(xì)胞因子例如IFNs的產(chǎn)生。弓莉[11]以雞傳染性囊病病毒感染雞為模型,應(yīng)用RT-PCR方法對(duì)90只11日齡嶺南黃肉雞 TLR7 mRNA進(jìn)行半定量檢測(cè)。通過區(qū)組試驗(yàn)對(duì)比得知脾臟組織中TLR7 mRNA表達(dá)強(qiáng)度和升高幅度比腔上囊組織中的大。試驗(yàn)結(jié)果表明,腔上囊病毒感染過程中TLR7 mRNA表達(dá)存在明顯的組織差異。Sean C A[12]等通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),雞感染H 11N 9亞型禽流感后,雞體內(nèi)外周血單核細(xì)胞中ChTLR7的表達(dá)量在感染前階段有短暫的上調(diào),隨后表達(dá)量下調(diào)。表明ChTLR7參與了雞體內(nèi)的抗病毒免疫反應(yīng)。

2.5 ChTLR15 Higgs R等[13]利用生物信息技術(shù)對(duì)雞基因組進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)一新的 TLR,即ChTLR15。ChTLR15同任何已知脊椎動(dòng)物的TLR都不同,應(yīng)為家禽所特有。ChTLR15基因已經(jīng)測(cè)序,發(fā)現(xiàn)落位于3號(hào)染色體,它具有原型的TIR功能域和轉(zhuǎn)膜區(qū)域及一個(gè)與眾不同的細(xì)胞外亮氨酸富有區(qū)域構(gòu)造。ChTLR15編碼一個(gè)含有868個(gè)氨基酸的蛋白,ChTLR15 mRNA在健康雞的脾臟、腔上囊、骨髓中都已被檢測(cè)到,揭示了這個(gè)新受體在宿主防御中的重要作用。用鼠傷寒沙門菌感染雞,然后進(jìn)行定量RT-PCR,試驗(yàn)結(jié)果顯示,雞被感染后,盲腸中TLR15表達(dá)顯著提高。體外研究表明,用熱滅活的鼠傷寒沙門菌刺激雞胚胎成纖維細(xì)胞,TLR15表達(dá)水平也會(huì)上升。Jessica R等[9]通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在不做任何刺激的條件下,沙門菌抗性雞群異嗜白粒細(xì)胞TLR15 mRNA的表達(dá)量比易感雞群的高。用腸炎沙門菌刺激后,兩組的 TLR15 mRNA表達(dá)量均比刺激前有明顯的增加。這些結(jié)果表明,ChTLR15的表達(dá)水平與家禽品系相關(guān),并且影響家禽抵抗腸炎沙門菌的能力。

3 ChTLRs的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)

哺乳動(dòng)物細(xì)胞通過識(shí)別PAMP激活TLRs引起信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng),參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的分子有：接頭蛋白MyD88、Toll相互作用蛋白(To11-interacting protein,簡(jiǎn)稱 Tollip)、IL-1受體相關(guān)激酶(IL-IR-assiocated kinase,簡(jiǎn)稱IRAK)和腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(tumor necrosis factor receptor-associated factor 6,簡(jiǎn)稱 TRAF6)[14]。MyD88結(jié)構(gòu)上有3個(gè)功能區(qū)域：N端的死亡區(qū)域(death domain,DD)、中間區(qū)域及C端的TIR。TLRs在細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制大體如下：首先激活的TLR募集一種相適配的蛋白,MyD88,與其C端的TIR結(jié)合形成受體復(fù)合物。接著My D88募集IRAK,My D88的N端死亡結(jié)構(gòu)域與在它下游的信號(hào)傳導(dǎo)分子IRAK的死亡結(jié)構(gòu)域結(jié)合,形成 TLR復(fù)合物。Tollip在TLR信號(hào)傳導(dǎo)途徑中起著負(fù)調(diào)節(jié)作用,與IRAK復(fù)合,功能與TLR2和 TLR4的作用相關(guān)。IRAK發(fā)生自身磷酸化并從復(fù)合物中解離出來,借此,Tollip可以與 TRAF6相互作用并激活TRAF6,將活化信號(hào)傳遞給TRAF6[15]。通過ECSIT(evolutionarily conserved signaling intermediate in Toll pathways)和MEKK-1(mitogen-activated protein kinase/ERK kinase kinase-1,促分裂原活化蛋白激酶的激酶1),TRAF6激活NF-κB抑制劑激酶(IKK)復(fù)合物,導(dǎo)致復(fù)合物分解,從而釋放NF-κB[16]。借助 TAK1以及相關(guān)蛋白 TAB1和TAB2,TRAF6也可以完成上述功能。最后,NF-kB導(dǎo)致某些特定的免疫基因發(fā)生轉(zhuǎn)錄活化并表達(dá)。

目前對(duì)雞體中參與TLR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子研究比較少,只有部分分子得到初步認(rèn)識(shí)。利用生物信息學(xué)方法,已經(jīng)鑒定出雞 Tollip、IRAK-4、Mal和TAB1的全序列和 MyD88、TRAF6、TAK1、TAB2、IKKα和IKKβ的部分序列。雞細(xì)胞內(nèi)的Mal,是一種類似MyD88的蛋白,結(jié)合在IRAK-2上,它也存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞,在其體內(nèi)作用是募集IRAK-2到被激活的 TLR4上。雞的Mal全長(zhǎng)是242 aa,與人的Mal有52%的同一性。至于雞Mal是否有上述同樣的功能,仍需進(jìn)一步研究。雞的IRAK-4全長(zhǎng)是414 aa,與人的IRAK-4有58%的同一性。雞 Tollip的長(zhǎng)度是281 aa,與人、鼠的Tollip有94%的同一性。這種高度保守性表明雞Tollip在功能上與人、鼠的很相似。雞 TAB1的全長(zhǎng)是506 aa,與人的TAB1有86%的同一性。雞TAB1包含保守的2C蛋白磷酸酶區(qū)域,這個(gè)區(qū)域也存在于人和鼠。研究表明,雞通過這些分子激活NF-κB的途徑,與哺乳動(dòng)物相似。

4 結(jié)語及展望

Toll樣受體(Toll-like receptors,TLR)是一個(gè)序列高度保守而古老的家族。它是連接天然免疫和獲得性免疫的重要橋梁。自發(fā)現(xiàn) Toll及 TLRs至今,經(jīng)過多年的研究,人們對(duì) TLRs家族成員的結(jié)構(gòu)、功能、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制等有了比較深入的了解,并不斷發(fā)現(xiàn)新的TLRs配體。但這些研究大多僅限于哺乳動(dòng)物,尤其在人和小鼠中對(duì)雞的研究甚少。如果能進(jìn)一步詳盡地了解ChTLRs的結(jié)構(gòu)功能與其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制,深入研究ChTLRs與某些疾病的關(guān)系,則必將為新型疫苗和免疫佐劑的研發(fā)提供新的科學(xué)依據(jù),為雞的抗病育種提供一個(gè)新的靶點(diǎn)。ChTLRs在免疫系統(tǒng)中的重要性,預(yù)示著對(duì)ChTLRs的研究必將掀起一番熱潮。

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