弓形蟲抗原表位研究進展*

王艷華,殷 宏,張德林,付寶權

弓形蟲抗原表位研究進展*

王艷華,殷 宏,張德林,付寶權

弓形蟲是一種呈全球分布的專性細胞內(nèi)寄生原蟲,廣泛寄生于人和動物的有核細胞內(nèi),能引起嚴重的人獸共患寄生蟲病。因此,對弓形蟲及弓形蟲病的研究日趨得到學者們的重視。由于弓形蟲生活史較復雜,抗原成分多,每種抗原在體內(nèi)誘導的免疫效應不同,實驗證明,單價亞單位疫苗免疫效果和單一抗原診斷試劑檢測效果均不理想,研制多表位疫苗和診斷試劑必然是一個新的發(fā)展趨勢。因此,正確而詳細地了解蛋白質表位對疾病的診斷以及設計疫苗分子結構具有重要理論和現(xiàn)實意義。本文就弓形蟲表位研究進展加以綜述。

1 抗原表位及分類

抗原表位(epitope)又稱抗原決定簇(antigenic determination),是指抗原分子上能刺激機體產(chǎn)生抗體或致敏淋巴細胞并能夠被其識別的一個免疫活性區(qū)。免疫細胞通常難以借助其表面受體識別整個蛋白質分子,而僅識別抗原肽分子上的表位,嚴格來說,抗體的特異性是針對表位而不是針對完整的抗原分子的〔1〕。表位一般只占5～7個氨基酸或單糖殘基的大小,最多不超過30個氨基酸殘基。按與抗原受體細胞結合不同,分為B細胞抗原表位和T細胞抗原表位;按表位結構不同分為連續(xù)性抗原表位和非連續(xù)性抗原表位,前者又稱線型表位,是由肽鏈上順序連續(xù)的氨基酸組成,后者又稱構象型抗原表位,是由空間鄰近但順序上不連續(xù)的氨基酸組成〔2〕。線型表位多見于T細胞表位,也可見于B細胞表位,構象型表位只見于B細胞表位。

一個蛋白質抗原,它不但含有與免疫識別密切相關的B細胞、T細胞、CT L細胞、NK細胞等表位結構,同時還含有一些對于保護性免疫不利的結構。此外,表位間的相對位置、構象特征、表位側翼順序等與表位功能的表達密切相關。再有MHC限制位(Agretope)、組織位(Histotope)等相關結構對表位的功能表達亦具有影響。許多研究發(fā)現(xiàn),天然蛋白質在引發(fā)免疫反應時,不能滿足清除病原體的需要。究其原因,一是因為隱匿的保護性表位功能未能表達,因而所引發(fā)的保護性免疫不夠強大。二是所引發(fā)的免疫反應發(fā)生了免疫偏移(Deviation),甚至造成T、B細胞間或T細胞亞群間互相殘殺從而加重感染。因此,對于抗原性的研究不得不從天然抗原整個分子水平向表位水平過渡。另外,就同一表位而言,表位內(nèi)氨基酸殘基對抗原性的貢獻也有不同,表位內(nèi)各氨基酸殘基的組成和順序決定了抗原的特異性〔3〕。

2 弓形蟲抗原表位研究方法

2.1 噬菌體展示技術 噬菌體展示技術是Smith等〔4〕于 1985 年創(chuàng)建的 。1988 年 Parmley 等〔5〕提出通過構建隨機肽庫可以了解抗體識別的抗原表位的設想。1990年Scott等〔6〕首次將噬菌體隨機肽庫應用于抗原定位,自此,國內(nèi)外學者進行了大量的相關研究。

噬菌體展示技術是研究蛋白抗原表位的強有力工具,利用隨機肽庫中可以同時獲得蛋白抗原線型表位和構象型表位,而且這種方法不必預先確定蛋白質的氨基酸序列。其基本原理是將待選基因片段定向插入噬菌體外殼蛋白質基因區(qū),使外源多肽或蛋白質表達并展示于噬菌體表面,并保持特定的空間構象,然后通過特異性親和作用來篩選特異性蛋白或多肽。這項技術被廣泛應用于弓形蟲抗原表位研究,極大地推動了弓形蟲抗原表位的研究進程。

2001年Beghetto等〔7〕首次用孕婦患者血清篩選弓形蟲cDNA λ噬菌體展示文庫,對篩選出來的陽性克隆進行序列分析,發(fā)現(xiàn)與弓形蟲致密顆?？乖璆RAl的序列相一致,利用抗體反應實驗證實存在一個24肽優(yōu)勢免疫表位。

2003年Beghetto等〔8〕利用患者血清篩選弓形蟲cDNA λ噬菌體展示文庫,獲得了GRA3、SAG1、GRA1、GRA7、GRA8和 MIC5的B細胞表位。而且,還鑒定了編碼GRA3和MIC3基因的兩個免疫顯性區(qū)。2002年 Robben等〔9〕將弓形蟲基因組DNA＜500bp的短基因片段插入到絲狀噬菌體M13基因Ⅲ區(qū),構建了弓形蟲全基因噬菌體文庫,用抗GRA3的單克隆抗體篩庫,得到GRA3的抗原表位。

國內(nèi),2003年吳翔〔10〕等以純化的弓形蟲免疫兔血清IgG篩選噬菌體隨機12肽庫,獲得的27個克隆中有24個能與弓形蟲單克隆抗體及免疫兔血清發(fā)生反應,混合最強的4個陽性克隆免疫小鼠,1月后用致死量弓形蟲攻擊感染,其存活時間明顯長于對照組。2004年林綺萍等〔11〕用同樣的方法對弓形蟲表位進行了篩選,獲得了弓形蟲抗原的有效模擬表位,對其中的一個陽性克隆插入的肽段進行序列測定,其序列為 5'- CTTCAGT TGGATCGGGCTCCGT TT TGGAAT CAGGGT-3',對應氨基酸序列為:LQLDRAPFWNQG,與Gen-Bank的弓形蟲已知序列無一級結構的同源性,對表位的免疫保護效果研究表明獲得的表位能誘導對弓形蟲的部分保護作用。

噬菌體展示技術憑借著自己獨特的優(yōu)勢,在生物科學研究和應用中的前景已經(jīng)逐漸地顯現(xiàn)出來。其優(yōu)點是:①生產(chǎn)成本低廉。由于不需復雜費時的后期純化過程,使成本大大降低。②噬菌體顆粒穩(wěn)定性好,非常適用研究和應用。③可模擬天然多肽表位結構或功能。④噬菌體作為表位載體在無佐劑的情況下具有較好的免疫原性。

2.2 抗原表位預測法 采用免疫信息學方法對抗原表位進行預測已成為表位定位必不可少的工具,可減少盲目性,提高表位預測的準確性,大大降低實驗費用,是一種經(jīng)濟而有效的方法。

1994年 Godard等〔12〕利用軟件對 SAG1表位進行預測,然后合成這些表位(48～67,82～102,213～230,238～256和279～285肽)并對這些表位進行了鑒定。發(fā)現(xiàn)238～256肽存在T細胞表位。在不需要任何載體蛋白的情況下,不管是通過口服還是肌肉注射進行免疫,這種肽均能誘導B細胞和T細胞免疫反應。

1996年Saavedra等〔13對弓形蟲 ROP2表位進行預測,選出一些表位(197～216、393～ 410和501～524肽)人工合成,以弓形蟲ROP2特異性人 T細胞克隆(TCC32)識別合成肽。獲得2個T細胞表位(197～216和501～524肽)。

2007年曹利民等〔14〕應用BioSun軟件對6個目前研究較多的弓形蟲主要抗原分子SAG1、SAG2、SAG3、GRA 1、GRA6和P35中的B細胞表位進行了預測,并從每個分子中選出2個抗原性較高的表位。構建了12個原核表達質粒,有11個表位基因能有效表達重組融合蛋白;經(jīng)Western blot鑒定,獲得3個弓形蟲B細胞表位,為進一步構建弓形蟲復合表位抗原診斷弓形蟲病奠定了基礎。

2008年張玉英等〔15〕利用生物信息學軟件對SAG3基因結構和功能進行預測分析,推測SAG3的氨基酸功能域可能位于65～198位與206～326位之間。

盡管許多預測表位的免疫信息學方法已被建立和應用,但由于機體內(nèi)免疫應答機制的復雜性,表位預測還不能完全反應體內(nèi)實際情況;而且許多預測方法存在一定的局限性,有待完善。相信隨著免疫學、信息學、分子生物學各領域的研究人員密切合作,表位預測的研究將取得突破性進展。

另外,還有些學者將基因分段進行表達,然后利用單抗或多抗來篩選出能引起陽性反應的片段,以獲得抗原表位。

1993年 Murray等〔16〕對弓形蟲 GRA2 C 末端59氨基酸的片段研究發(fā)現(xiàn)它至少存在3個B細胞表位。

1998年 Mevelec等〔17〕對截短的弓形蟲 GRA4抗原性和免疫原性進行了研究,發(fā)現(xiàn)其C末端的11個氨基酸存在一個主要的B細胞表位,第二個B細胞表位識別的頻率較低,位于318～334氨基酸,在N端25～276的氨基酸序列中沒有明顯的B細胞表位存在。

2003年李越希等〔18〕根據(jù)弓形蟲GRA6蛋白和P30蛋白的氨基酸序列,通過計算機分析,篩選出其中較強的抗原表位,用PCR方法分別擴增了內(nèi)含這兩種蛋白抗原表位的基因片段,成功的構建含兩者抗原表位的融合蛋白工程菌并進行了表達,ELISA法證實該蛋白有較好的抗原性和特異性,可用作抗原檢測弓形蟲抗體。

3 弓形蟲抗原表位研究的應用

3.1 弓形蟲多表位疫苗研究 人工設計的復合多表位疫苗可預防疾病的各個階段或同時預防多種疾病,因而被認為是將來疫苗發(fā)展的理想方向。在弓形蟲表位疫苗研究方面,國內(nèi)外都進行了大量的研究工作,既有單個表位疫苗功能的研究有又多表位疫苗的研究。

2007年,范久波等〔19〕采用生物信息學方法對新基因2B9G1、7C3-C3進行表位預測,PCR擴增編碼3個表位的基因片段,構建了單表位、雙表位、多表位疫苗質粒,但遺憾的是其保護性如何未見報道。

2008年,譚逵等〔20〕對弓形蟲新基因wx2進行表位分析預測,制備了新基因的單表位核酸疫苗和雙表位核酸疫苗。結果3種新基因的表位疫苗均能產(chǎn)生一定的保護效應,使實驗小鼠的存活時間明顯延長,且雙表位疫苗優(yōu)于單表位疫苗。證實DNA類表位疫苗的研制可作為弓形蟲疫苗研究的策略之一。

2008年叢華等〔21〕將已知的弓形蟲主要抗原SAG1、GRA1 、ROP2和GRA4的表位串聯(lián)起來,制備了多表位核酸疫苗并對其進行了評價。結果證實該疫苗能引起重要的體液免疫和細胞免疫反應并能延長用致死量的 RH株速殖子感染小鼠的存活時間。

史霖等〔22〕構建成含 SGA1、GRA1、GRA4 和GRA2多個T、B細胞表位的弓形蟲DNA疫苗。以該多表位DNA疫苗免疫BALB/c小鼠,可誘導其產(chǎn)生特異性的體液和細胞免疫應答,免疫小鼠對致死劑量弓形蟲 RH株速殖子的感染攻擊具有部分抵抗作用,免疫小鼠存活期顯著延長。

多表位疫苗與傳統(tǒng)疫苗相比有很多優(yōu)勢,首先其安全性好,且誘發(fā)的免疫應答針對性強。其次,表位疫苗能剔除免疫反應中的某些不利因素,如負性調節(jié)的基因及非特異性成分,以及可以避免完整抗原與宿主同源性而引起的自身免疫反應等危害。表位疫苗也可通過選擇適當?shù)拿庖叻绞?能誘導機體產(chǎn)生很強的細胞免疫,這對細胞內(nèi)寄生的弓形蟲尤其重要。

3.2 弓形蟲多表位診斷試劑研究 由于弓形蟲在人體和動物中寄生呈多階段性,而不同階段蟲體的抗原具有特異性,所以以單一抗原尤其是階段特異性的單一抗原制備的試劑盒,對弓形蟲病進行檢測容易出現(xiàn)漏檢現(xiàn)象。從弓形蟲某些特異性抗原,尤其是不同階段蟲體共有抗原中選出優(yōu)勢抗原表位,將它們串聯(lián)起來進行表達,獲得基因重組多表位抗原,用其作為診斷抗原檢測弓形蟲病理論上有望克服漏檢現(xiàn)象。國內(nèi)外學者對多表位抗原在弓形蟲免疫檢測中的應用前景進行了探討。

2003 年 Beghetto 等〔23〕用含有 GRA3、SAG1、GRA1和GRA7表位的重組抗原建立了弓形蟲IgG抗體親和力試驗,可以區(qū)分孕期弓形蟲急性和隱性感染。

國內(nèi),楊培梁等〔24-25〕用含 SAG1、ROP2、GRA2抗原表位重組可溶性抗原建立ELISA方法,對兔和小鼠的急慢性弓形蟲感染血清進行了檢測。結果檢測的141份小鼠血清,其中慢性感染弓形蟲小鼠血清117份、正常小鼠血清24份,檢測體系的敏感性為88.88%,特異性為91.67%,一致性為89.36%。檢測的24份兔血清,其中急性感染弓形蟲兔血清18份,正常兔血清6份,陽性血清檢出率為94.4%,總一致性為91.5%。證明以弓形蟲多表位重組抗原構建的ELISA試劑盒既可以檢測弓形蟲急性感染血清,又可以檢測弓形蟲慢性感染血清,具有一定的應用前景。

4 小 結

多表位抗原在對抗原成分選擇上具有多樣性,在具體操作上也因各種先進的分子生物學手段和完善的基因工程技術而具有可行性。但截止到目前,盡管已設計出了一些多表位肽疫苗和診斷試劑,但仍存在一些問題需要解決:①多肽單獨應用其免疫原性較差,可能是因為外源多肽在體內(nèi)降解較快。②抗原表位的選擇,怎樣才能選擇出能使機體獲得最佳免疫保護或適用于檢測急、慢性診斷試劑的抗原表位,目前缺乏實驗和理論依據(jù)。③免疫佐劑的使用,特別是新型免疫佐劑如CpG和QS21如何與抗原表位聯(lián)合應用才能取得最佳效果,尚待進一步研究。④對于CD1呈遞和直接呈遞尚缺乏尋找表位的方法。⑤缺乏合理弓形蟲疫苗評估方法。在自然條件下多是以緩殖子、包囊和卵囊的形式感染宿主,引起宿主的慢性感染。而選用強毒株速殖子進行攻擊感染,常常引起的是實驗動物的急性感染死亡,因而不能全面客觀評估疫苗的保護性。另外,攻擊劑量也值得進一步進行研究。

〔1〕周光炎.免疫學原理〔M〕.上海:上?？萍汲霭娑?2000:36-37.

〔2〕Barlow DJ,Edwards MS,Thornton JM.Continuous and discontinuous protein antigenic determinants〔J〕.Nature,1986,322(6081):747.

〔3〕吳玉章,朱錫華.對表位生物學研究的認識和體會〔J〕.上海免疫學雜志,1998,18(1):1-2.

〔4〕 Smith GP.Filamentous fusion phage:novel ex pression vectors that display cloned antigens on the virion surface〔J〕.Science,1985,228(2):1315-1317.

〔5〕Parmley SF,Smith GP.Antibody-selectable filamentous fd phage vectors:affinity purification of target genes〔J〕.Gene,1988,73:305-318.

〔6〕Scott J K,Smith G P.Searching for peptide ligands with an epitope library〔J〕.Science,1990,249(1):386-390.

〔7〕Beghetto E,Pucci A,Minenkova O,et al.Identification of a human immunodominant B-cell epitope within the GRA1 antigen ofToxoplasma gondiiby phage display of cDNA libraries〔 J〕.International Journal for Parasitology,2001,31(14):1659-68.

〔8〕Beghetto E,Spadoni A,Buffolano W,et al.Molecular dissection of the human B-cell response againstToxoplasma gondiiinfection by lambda display of cDNA libraries〔J〕.Int J Parasitol,2003,33(2):163-173.

〔9〕Robben J,Hertveldt K,Bosmans E,et al.Selection and identification of dense granule antigen G RA3 byToxoplasma gondiiwhole genome phage display 〔J〕.J Biol Chem,2002,277(20):17544-17547.

〔10〕吳翔,蔣立平,蔡力汀,等.隨機肽庫篩選弓形蟲特異性抗原表位誘導保護性免疫的研究〔J〕.中國人獸共患病雜志,2003,19(4):42-44.

〔11〕林綺萍,吳少庭,翁亞彪,等.等弓形蟲有效抗原表位的篩選及其對小鼠免疫保護性的研究〔J〕.中國熱帶醫(yī)學,2004,4(5):685-688.

〔12〕 Godard I,Estaquier J,Zenner L,et al.Antigenicity and immunogenicity of P30-derived peptides in experimental models of toxoplasmosis〔 J〕.Molecular immunology,1994,31(17):1353-1363.

〔13〕Saavedra R,Becerril M A,Dubeaux C,et al.Epitopes recognized by human T lymphocy tes in the Rop2 protein antigen ofToxoplasma gondii〔J〕.InfectImmun,1996,64(9):3858-3862.

〔14〕曹利民.潘宇紅.盧志賢,等.剛地弓形蟲主要抗原B細胞表位的篩選及鑒定〔J〕.國際醫(yī)學寄生蟲病雜志,2007,19(1):24-27.

〔15〕張玉英,賀新紅,陳莎麗,等.弓形蟲SA G3基因克隆及生物信息學分析〔J〕.中國病原生物學雜志.2008.3(6):428-430.

〔16〕Murray A,M ercier C,Decoster A,et al.Multiple B-cell epitopes in a recombinant GRA2 secreted antigen ofToxoplasma gondii〔J〕 .Applied Parasitology,1993,34(4):235-244.

〔17〕Mevelec MN,Mercereau-Puijalon O,Buzoni-Gatel D,et al.Mapping of B epitopes in GRA4,a dense granule antigen ofToxoplasma gondiiand protection studies using recombinant proteins administered by the oral route〔J〕.Parasite Immunol,1998,20(4):183-195.

〔18〕李越希,張錦海,陶開華,等,弓形蟲GRA6蛋白和P30蛋白的融合表達、純及抗原性分析〔J〕.生物工程學報,2003,19(6):34-39.

〔19〕范久波,吳翔,譚逵,等.弓形蟲新基因表位疫苗質粒的構建及鑒定〔J〕.中國病原生物學雜志,2007,2(2):118-121.

〔20〕譚逵,張瓊,范久波,等,弓形蟲新基因wx2表位疫苗免疫小鼠的保護研究〔J〕.生物化學與生物物理進展,2008,53(9):1051-1058.

〔21〕Cong H,Gu Q M,Yin H E,et al.Multi-epitope DNA vaccine linked to the A2/B subunit of cholera toxin protect mice againstToxoplasma gondii〔J〕.Vaccine,2008,26:3913-3921.

〔22〕史霖,劉珊,程雁斌,等.弓形蟲多表位 DNA疫苗的構建及其免疫保護作用〔J〕.細胞與分子免疫學雜志,2008,24(7):689-691.

〔23〕 Beghetto E,Buffolano W,Spadoni A,et al.Use of an immunoglobulin G avidity assay based on recombinant antigens for diagnosis of primaryToxoplasma gondiiinfection during pregnancy 〔J〕.J Clin Microbiol,2003,41(12):5414-5418.

〔24〕楊培梁,陳曉光.弓形蟲多表位基因的構建及其在大腸桿菌系統(tǒng)中的表達鑒定〔J〕.中國人獸共患病雜志,2002,18(2):37-40.

〔25〕楊培梁,李華,周曉紅,等.弓形蟲多表位基因重組抗原在弓形蟲免疫檢測中的應用〔J〕.熱帶醫(yī)學雜志,2007,7(9):853-855.

R531.8

A

1002-2694(2010)01-0084-04

*國家科技支撐計劃項目(2007BAD40B05)

張德林,Email:zhangdl2005@163.com

1.中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所,家畜疫病病原生物學國家重點實驗室,農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點開放實驗室,甘肅省動物寄生蟲病重點實驗室,蘭州730046

2009-06-11;

2009-11-07