高效毛細(xì)管電泳技術(shù)在中藥指紋圖譜研究中的應(yīng)用Δ

江尚飛，楊元娟，何 靜，蔣紅艷，唐 倩，蘭作平

（重慶醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校藥學(xué)系，重慶市 400030）

中藥指紋圖譜的建立對中藥質(zhì)量進(jìn)行整體描述和評(píng)價(jià)，對控制中藥及中藥制劑的質(zhì)量，促進(jìn)中藥現(xiàn)代化都具有很重要的意義。指紋圖譜作為中藥及其制劑的質(zhì)量控制方法，目前已成為國際共識(shí)，各種符合中藥特色的指紋圖譜控制技術(shù)體系正在研究和建立[1]。

目前，用于中藥成分分析的方法很多，中藥指紋圖譜技術(shù)已涉及眾多方法，包括薄層掃描（TLCS）、高效液相色譜（HPLC）、氣相色譜（GC）和高效毛細(xì)管電泳（HPCE）等色譜法以及紫外光譜（UV）、紅外光譜（IR）、質(zhì)譜（MS）、核磁共振（NMR）和X-射線衍射等光譜法[2]。其中HPLC法最常用。但用HPLC法進(jìn)行中藥成分分析往往分析時(shí)間長、分離效率低，而且色譜柱容易被污染，并且色譜柱上沉積的污染物經(jīng)常以雜質(zhì)峰的形式出現(xiàn)，影響分析結(jié)果，對于含極性成分較多的中藥，其“指紋”的特征不強(qiáng)[3]。

毛細(xì)管電泳（CE），亦稱HPCE，是近十幾年來發(fā)展很快的一種高效分離分析技術(shù)，即離子或荷電離子以電場為驅(qū)動(dòng)力，在毛細(xì)管中按其淌度或分配系數(shù)不同實(shí)現(xiàn)分離的一類電泳分離新技術(shù)，具有分離效率高、速度快、靈敏度高、所需樣品少、溶劑消耗少、成本低、前處理簡單、抗污染能力強(qiáng)、應(yīng)用范圍廣等特點(diǎn)[4]。CE按分離模式的不同分為以下9類：毛細(xì)管區(qū)帶電泳（CZE）、膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜（MECC）、毛細(xì)管凝膠電泳（CGE）、毛細(xì)管等電聚焦電泳CIEF）、毛細(xì)管等速聚焦電泳（CITP）、毛細(xì)管電色譜（CEC）、親和毛細(xì)管電泳（AEC）、毛細(xì)管電動(dòng)色譜（EKC）、非水相毛細(xì)管電泳（NACE），其中CZE和MECC應(yīng)用較為廣泛[5，6]，但近年來NACE發(fā)展很快，應(yīng)用越來越多。目前，各類CE方法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于中藥及中藥制劑指紋圖譜的研究[7，8]。

1 HPCE技術(shù)在植物類中藥指紋圖譜中的研究應(yīng)用

孫國祥等[9]以10個(gè)不同產(chǎn)地的玄參建立了HPCE指紋圖譜。玄參用水回流提取后，用50 mmol·L-1硼砂溶解制得樣品，以5-羥甲基糖醛（5-HMF）、哈巴俄苷、肉桂酸作對照品，用石英毛細(xì)管柱，以50 mmol·L-1硼砂溶液作緩沖液，在運(yùn)行電壓12.1 kV、電流約0.108 mA、紫外檢測波長280 nm條件下進(jìn)行分析，獲得不同產(chǎn)地玄參藥材的指紋圖譜，并具有良好的重現(xiàn)性與精密度，按共有峰出現(xiàn)率f i＝100%計(jì)，確定玄參藥材中的10個(gè)中藥指紋峰。并以對照品對不同產(chǎn)地玄參的HPCE指紋圖譜進(jìn)行評(píng)價(jià)，得出3產(chǎn)地質(zhì)量完全合格，4產(chǎn)地含量明顯偏低，3產(chǎn)地含量明顯偏高，為玄參藥材及其制劑的質(zhì)量控制提供了新的依據(jù)。楊宏濤等[10]采用MCC法，以30 mmol·L-1硼砂+10 mmol·L-1十二烷基硫酸鈉（SDS）為緩沖液，運(yùn)行電壓為12 kV，紫外檢測波長為205 nm，以10個(gè)不同產(chǎn)地藥材的電泳圖譜建立了苦參的對照毛細(xì)管指紋圖譜。建立的苦參CE數(shù)字化指紋圖譜具有較好的精密度和重現(xiàn)性，準(zhǔn)確簡便，測定費(fèi)用低且方法學(xué)考察符合規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)，可作為控制苦參藥材內(nèi)在質(zhì)量的有效手段。Yu K等[11]在對黃芩CE研究中，優(yōu)化條件，以黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素作為控制標(biāo)準(zhǔn)建立黃芩毛細(xì)管指紋圖譜，對34個(gè)不同產(chǎn)地的黃芩進(jìn)行質(zhì)量分析控制，方法快速、精密、可靠，對所有來源的藥材進(jìn)行了質(zhì)量評(píng)價(jià)。

劉金丹等[12]模仿工業(yè)化用乙醇回流提取水沉再進(jìn)一步純化對甜瓜蒂進(jìn)行成分分析，以50 mmol·L-1硼砂（含體積分?jǐn)?shù)為5%的乙腈溶液）作為緩沖溶液，在12 kV電壓下操作，紫外檢測波長為228 nm，以10個(gè)不同產(chǎn)地藥材的電泳圖譜建立了甜瓜蒂CE指紋圖譜，確立11個(gè)共有峰，結(jié)合雙定性雙定量相似度評(píng)價(jià)法較好地實(shí)現(xiàn)了對甜瓜蒂藥材質(zhì)量的全面數(shù)字化控制，并為其它色譜指紋圖譜方法研究及中藥生產(chǎn)質(zhì)量控制提供有益參考。有人用甲醇超聲提取蓮子心制備供試樣品，采用CZE模式，壓力進(jìn)樣10 s，分離電壓為30 kV，柱溫為25℃，檢測波長為282 nm，運(yùn)行緩沖液由100 mmol·L-1硼酸、100 mmol·L-1KOH按4∶2的比例配置（pH 8.90），以蓮心堿為對照品分析得到不同來源的蓮子心CE圖譜，從中選定15個(gè)共有峰作為構(gòu)成蓮子心提取物指紋圖譜穩(wěn)定的特征峰，建立HPCE指紋圖譜。相似度均在0.900～1.000之間，其指紋圖譜整體面貌基本一致，為蓮子心提取物的定性鑒別及內(nèi)在質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了新的方法和依據(jù)。蔣迎道等[13]用醇提取山茱萸成分，乙醚脫脂，經(jīng)水飽和的正丁醇反復(fù)萃取，并脫水得山茱萸有效部位配制50 g·L-1的水溶液，以pH 9.5、50 mmol·L-1的硼砂溶液作為緩沖液，操作電壓為22 kV（+）→（－），進(jìn)樣壓力為34.5 kPa·s，柱溫為30℃，200 nm紫外檢測條件下，獲得最優(yōu)條件下的山茱萸CZE和MECC化學(xué)特征指紋圖譜，并具有良好的重現(xiàn)性與精密度，建立了滿意的山茱萸HPCE指紋圖譜，為相關(guān)的藥效研究和生產(chǎn)過程控制提供了依據(jù)。曹敏等[14]采用50 mmo·L-1硼酸鹽+10 mmol·L-1磷酸鹽為緩沖液，以內(nèi)徑50 μm、有效長度50 cm的CZE測定了梔子藥材指紋圖譜，探討以梔子內(nèi)在質(zhì)量控釋的標(biāo)準(zhǔn)。

李玉蘭等[15]采用CZE法，以50 mmol·L-1硼砂水溶液+100 mmol·L-1硼酸水溶液（2∶1）為背景電解質(zhì)緩沖溶液，運(yùn)行電壓為20 kV，紫外檢測波長為254 nm，流體力學(xué)進(jìn)樣10 s（壓力，5×103Pa），對28批小花鬼針草進(jìn)行分析，建立小花鬼針草的CE特征圖譜，方法速度快，并且精密度、重復(fù)性及穩(wěn)定性試驗(yàn)中，各特征峰的相對遷移時(shí)間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）小于6%，相對峰面積的RSD小于10%，可作為小花鬼針草的CE指紋圖譜，可用于快速鑒定小花鬼針草。孫國祥等[16]以40 mmol·L-1硼砂溶液為緩沖液，壓力進(jìn)樣6 s，在電壓17 kV、溫度25℃條件下建立了不同產(chǎn)地金銀花的HPCE指紋圖譜，可作為金銀花內(nèi)在質(zhì)量的控制標(biāo)準(zhǔn)。

2 HPCE技術(shù)在動(dòng)物類中藥指紋圖譜中的研究應(yīng)用

雒翠霞[17]等用10個(gè)不同來源地的南方大斑蝥60℃干燥粉碎后，用75%乙醇回流提取，水沉除雜，減壓回收乙醇后殘?jiān)儆盟ㄈ葑鞴┰囈?。在紫外檢測波長265 nm、靈敏度0.005 AUFS、運(yùn)行電壓12 kV、電流約60 mA、緩沖液為50 mmol·L-1硼砂溶液條件下，重力進(jìn)樣20 s，高度8 cm進(jìn)行HPCE試驗(yàn)，測定10個(gè)不同產(chǎn)地斑蝥藥材指紋圖譜。以尿苷峰為參照物峰，按出現(xiàn)率100%確定10個(gè)共有峰。并對這些信息特征進(jìn)行數(shù)字化評(píng)價(jià)[18]，與對照指紋圖譜比較，其定量相似度全部合格。并且對斑蝥的翅、足、頭和軀干制備樣品溶液，以同樣條件進(jìn)行試驗(yàn)，其指紋圖譜與對照指紋圖譜的定性相似度分別為0.971、0.882、0.855，比率定性相似度分別為0.923、0.906、0.827，說明斑蝥頭、足、翅與全蟲相比，化學(xué)成分分布較為相似，三者存在并不影響斑蝥整體質(zhì)量，故斑蝥炮制時(shí)沒有必要去頭、足、翅。劉萍等[19]分別用天然牛黃、人工牛黃、人膽結(jié)石及一種牛黃偽品在冰浴中研磨成漿狀，高速離心后取上清液作供試樣品，在30 mmol·L-1硼酸鹽緩沖液（pH 8.5）、電壓20 kV、溫度20℃、紫外檢測波長200 nm、重力進(jìn)樣、時(shí)間5 s條件下對每個(gè)樣品檢測3次，測定各個(gè)樣品的峰數(shù)、出峰時(shí)間、峰面積，以樣品的電泳遷移時(shí)間（T）對峰面積（AU）作圖，并以該樣品所有特征峰的峰面積相加、峰高相加分別為100%，計(jì)算各個(gè)樣品的峰面積比值（A%）、峰高比值（H%），用Tris-甘氨酸、堿性蛋白、酸性蛋白作對照品，以Tris-甘氨酸、堿性蛋白、酸性蛋白提取液中特征峰的遷移時(shí)間、峰面積比與峰高比作比較，很好地區(qū)別出天然牛黃與人工牛黃、人膽結(jié)石、牛黃偽品。

3 HPCE技術(shù)在中藥制劑指紋圖譜中的研究應(yīng)用

中藥制劑成分更加復(fù)雜，生物活性成分的研究、控制已經(jīng)引起全球科學(xué)家的重視。班麗娜等[20]研究了西瓜霜制劑的HPCE方法，用制備的西瓜霜制劑作供試樣品，壓力進(jìn)樣，20 mmol·L-1緩沖液（pH 8.5），分離電壓為25 kV，分離溫度為25℃，檢測波長為206 nm，7 min內(nèi)有效測定了西瓜霜噴劑中多種有效成分的含量，精密度高，檢測快速。閆濱等[21]用HPCE法測定了克心痛滴丸中阿魏酸的含量，分辨能力強(qiáng)，能較好地把阿魏酸與干擾物分離，精密度高，重現(xiàn)性好，有機(jī)溶劑消耗少，測定成本低。丁娟娟等[22]將CE法應(yīng)用在動(dòng)物類中藥及富含氨基酸的中藥制劑的質(zhì)量控制中，這提供了新的試驗(yàn)手段，在中藥有效成分的分離檢測中顯示出較好前景。

4 HPCE技術(shù)中藥指紋圖譜研究展望

HPCE技術(shù)在中藥成分分析中的應(yīng)用雖然起步較晚，但在中藥分析領(lǐng)域中充分展示了其優(yōu)越性，有廣闊的應(yīng)用前景。它作為一種新的分離手段已應(yīng)用到分析的各個(gè)方面，且分離效率高、用量少、速度快、操作簡便、費(fèi)用低，在中藥及其復(fù)方制劑的分析、鑒定及指紋圖譜建立上提供了一種高效、準(zhǔn)確的方法。但是CE重現(xiàn)性較差、線性范圍窄、靈敏度低，尚無專屬的監(jiān)測器，若將HPCE技術(shù)聯(lián)用其他技術(shù)，如CE-MS、CENMR以及CE-MS-MS、HPLC-HPCE-MS、CE-原子發(fā)射光譜（AES）、CE-電感耦合等離子體（ICP）-MS[2]以及不同電泳技術(shù)之間的聯(lián)用[23]，會(huì)拓寬其應(yīng)用范圍，彌補(bǔ)其不足，達(dá)到快速完成眾多復(fù)雜成分的分離和結(jié)構(gòu)鑒定的目的，這在中藥及其復(fù)方制劑化學(xué)成分的分析中尤為重要。隨著儀器的不斷改進(jìn)，HPCE技術(shù)作為一種強(qiáng)有力的分析技術(shù)，在中藥質(zhì)量控制方面將大有作為，將會(huì)在中藥領(lǐng)域中發(fā)揮越來越重要的作用，在推動(dòng)中藥走向世界的進(jìn)程中作出巨大貢獻(xiàn)。

[1]孫國祥，慕善學(xué)，侯志飛，等.大青葉的毛細(xì)管電泳指紋圖譜研究Ⅱ[J].分析化學(xué)，2005，33（6）：853.

[2]韓曄華，霍飛鳳，楊悠悠，等.中藥指紋圖譜研究的某些進(jìn)展與展望[J].色譜，2008，26（2）：142.

[3]古 今，趙夕秋.毛細(xì)管電泳技術(shù)在中藥分析中的應(yīng)用[J].中國藥物應(yīng)用與監(jiān)測，2007，22（4）：50.

[4]孫國祥，宋 文，宋 楊，等.中藥的毛細(xì)管電泳指紋圖譜的研究方法[J].中南藥學(xué)，2008，6（6）：752.

[5]劉 雄，吳 蓉，高建德.毛細(xì)管電泳技術(shù)在中藥研究中的應(yīng)用[J].光明中醫(yī)，2009，24（3）：577.

[6]劉加寶.毛細(xì)管電泳在中藥現(xiàn)代化中的應(yīng)用[J].牡丹江大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，17（1）：128.

[7]Feng HT，Yuan LL，Li SF.Analysis of Chinese medicine preparations by capillary electrophoresis-mass spectrometry[J].J Chromatogr A，2003，1014（1～2）：83.

[8]周麗娟，劉清飛，王義明，等.毛細(xì)管電泳在中藥研究中的應(yīng)用[J].中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2007，9（2）：15.

[9]孫國祥，史香芬.玄參的毛細(xì)管電泳指紋圖譜研究[J].中南藥學(xué)，2009，7（7）：540.

[10]楊宏濤，孫國祥.苦參的毛細(xì)管電泳數(shù)字化指紋圖譜研究[J].中南藥學(xué)，2008，6（2）：96.

[11]Yu K，Gong Y，Lin Z，et al.Quantitative analysis and chromatographic fingerprinting for the quality evaluation of Scutellaria baicalensis Georgi using capillary electrophoresis[J].J Pharm Biomed Anal，2007，43（2）：540.

[12]劉金丹，孫國祥，池劍玲.甜瓜蒂的毛細(xì)管電泳數(shù)字化指紋圖譜[J].沈陽藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，25（7）：556.

[13]蔣迎道，梁 恒.山茱萸的毛細(xì)管電泳指紋圖譜[J].西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，38（2）：204.

[14]曹 敏，季一兵，陳玉英.梔子藥材毛細(xì)管電泳指紋圖譜的研究[J].中國藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，33（4）：284.

[15]李玉蘭，李 軍，劉 敏，等.小花鬼針草的毛細(xì)管電泳特征圖譜研究[J].藥物分析雜志，2009，29（2）：179.

[16]孫國祥，楊宏濤，鄧湘昱.金銀花的毛細(xì)管電泳指紋圖譜研究[J].色譜，2007，25（1）：96.

[17]雒翠霞，孫國祥，史香芬.斑蝥的毛細(xì)管電泳數(shù)字化指紋圖譜研究[J].中南藥學(xué)，2008，6（2）：230.

[18]孫國祥，侯志飛，張春玲，等.色譜指紋圖譜定性相似度和定量相似度的比較研究[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，2007，42（1）：75.

[19]劉 萍，古 今，馮建涌.牛黃人工牛黃人膽結(jié)石及一種牛黃偽品的毛細(xì)管電泳法鑒別[J].解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào)，2005，21（4）：307.

[20]班麗娜，許海棠，徐遠(yuǎn)金.桂林西瓜霜噴劑中鹽酸小檗堿、苦參堿與黃芩苷的毛細(xì)管電泳測定[J].分析測試學(xué)報(bào)，2008，27（11）：1217.

[21]閆 濱，馬 山，張秋紅，等.毛細(xì)管電泳法測定克心痛滴丸中阿魏酸的含量[J].中成藥，2005，27（1）：37.

[22]丁娟娟，金葆康，康經(jīng)武.毛細(xì)管電泳-激光誘導(dǎo)熒光用于中藥制劑中氨基酸成分的分析[J].化學(xué)學(xué)報(bào)，2009，67（9）：945.

[23]靳淑萍，李 萍，董樹清，等.毛細(xì)管電泳-電化學(xué)檢測法測定黃芪及其制劑中的活性成分[J].色譜，2009，27（2）：229.