口蹄疫核酸疫苗的研究進(jìn)展

王 猛，劉永生，張 杰

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所 家畜疫病病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 農(nóng)業(yè)部畜禽病毒學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室 農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730046)

口蹄疫 (FMD)是由口蹄疫病毒 (FMDV)引起的偶蹄動(dòng)物的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病。該病呈世界性流行，一旦暴發(fā)將給世界各國(guó)的畜牧業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，使得人們?cè)趹?yīng)對(duì)它時(shí)，必須側(cè)重于早期的防治。疫苗作為預(yù)防、控制傳染病的發(fā)生和流行的主要手段，在防控口蹄疫方面擔(dān)任著重要角色。口蹄疫疫苗主要經(jīng)歷傳統(tǒng)疫苗和基因工程疫苗兩個(gè)階段。雖然滅活疫苗和弱毒疫苗在防止口蹄疫的流行中發(fā)揮了重要作用，但是隨著防疫標(biāo)準(zhǔn)的提高及對(duì)生物安全的考慮，傳統(tǒng)疫苗開始顯露出種種缺陷，如對(duì)滅活苗免疫動(dòng)物和自然感染動(dòng)物區(qū)分不便，疫苗保存較耗時(shí)耗材，弱毒苗安全性較低等。隨著分子生物學(xué)研究的深入，基因工程疫苗成為目前研究的熱點(diǎn)。其中核酸疫苗由于生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單、便于保存和運(yùn)輸、無感染性、無反強(qiáng)且抗原相關(guān)表位穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)受到廣泛關(guān)注。

1 口蹄疫病毒的抗原性片段

FMDV的抗原位點(diǎn)多位于衣殼蛋白的環(huán)結(jié)構(gòu)上。FMDV衣殼蛋白 VP1-4都含有 T細(xì)胞表位。VP2-4至少含有10有活性的 T細(xì)胞表位，其中VP2和VP3上居多，但是在分離的結(jié)構(gòu)蛋白中只有VP1才能誘導(dǎo)中和抗體的產(chǎn)生［1］。FMDV的VP1 G-H環(huán)上，有誘導(dǎo)生成B細(xì)胞的位點(diǎn)，也有激發(fā)產(chǎn)生 Th細(xì)胞的位點(diǎn)，Zamorano等［2］對(duì) FMDV的Campos株的研究表明，在 VP1的135～140位和150～160位氨基酸殘基上，有2個(gè) T細(xì)胞抗原表位。雖然不同血清型的病毒抗原位點(diǎn)的組成有所不同，VP1的G-H環(huán)已被公認(rèn)包含重要的抗原決定簇［3］。生產(chǎn)核酸疫苗時(shí)保護(hù)性抗原基因可以是單個(gè)的基因 (如VP1)也可以是一組基因 (P1、2A、3C和3 D)，還可以是編碼VP1抗原位點(diǎn)的多個(gè)表位 (如VP1的141～160位氨基酸、200～213位氨基酸)［4］。

2 核酸疫苗的作用機(jī)理

研究表明核酸疫苗不僅可誘導(dǎo)體液免疫反應(yīng)，還可以誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答。重組質(zhì)粒一般通過肌肉或者皮內(nèi)導(dǎo)入機(jī)體后，被周圍組織細(xì)胞(比如肌細(xì)胞或者表皮膠原細(xì)胞)，抗原遞呈細(xì)胞(APC)或者其它炎性細(xì)胞攝取。未被攝取的游離DNA多數(shù)可被降解，少數(shù)可能隨循環(huán)系統(tǒng)而進(jìn)入淋巴結(jié)或脾中。有實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明，肌細(xì)胞、上皮細(xì)胞和黏膜細(xì)胞有較強(qiáng)地?cái)z取 DNA分子的能力［5］。之后被攝取的重組質(zhì)粒在細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄mRNA并在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)病原體的蛋白質(zhì)抗原，經(jīng)加工后形成的多肽抗原，可與宿主細(xì)胞主要組織相容性復(fù)合物MHCⅠ和 MHCⅡ分子結(jié)合，并被遞呈給宿主的免疫識(shí)別系統(tǒng)，從而引起特異性體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答［6-7］。

3 FMD核酸疫苗的研究進(jìn)展

最早有關(guān)核酸免疫研究的報(bào)道是從1990年Wolff等［8］將質(zhì)粒接種于小鼠的肌肉中開始的，而最初構(gòu)建的口蹄疫的基因疫苗是一個(gè)包含F(xiàn)MDV A12株cDNA全基因組的質(zhì)粒pWRM。但由于全基因組具有一定的危險(xiǎn)性，以后的研究者開始致力于只表達(dá)FMDV抗原表位的核酸疫苗的研究。

之后研究人員開始構(gòu)建的DNA重組疫苗表達(dá)FMDV VP1衣殼蛋白的抗原表位，因?yàn)閂P1上的B細(xì)胞表位能夠誘導(dǎo)中和抗體的產(chǎn)生。Wong等［9］利用編碼FMDV VP1基因表位的重組質(zhì)粒，生產(chǎn)一種口蹄疫核酸疫苗，實(shí)驗(yàn)證明可以誘導(dǎo)豬和小鼠的免疫反應(yīng)。此外也有表達(dá)整個(gè)P1基因的，但是要同時(shí)表達(dá)3 C基因，3 C編碼一種蛋白酶，裂解P1-2A 成為正確的抗原表位［10］。Benvenisti等［11］將FMDV完整的結(jié)構(gòu)基因P1和非結(jié)構(gòu)基因2 A、3 CD串聯(lián)起來，同時(shí)加入腦心肌炎病毒內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)，通過免疫熒光和免疫斑點(diǎn)技術(shù)檢測(cè)到病毒蛋白在體外表達(dá)和加工，利用基因槍注射到豬皮膚中，發(fā)現(xiàn)有部分豬可抵抗FMDV強(qiáng)毒的攻擊。2005年Yang Ning-su等［12］分別構(gòu)建編碼部分 VP1抗原位點(diǎn)、完整的VP1和P1的表達(dá)質(zhì)粒，同樣的方法免疫接種10周齡的BALB/cByJ小鼠后，發(fā)現(xiàn)編碼部分VP1抗原位點(diǎn)的核酸疫苗不能很好地誘導(dǎo)抗VP1的蛋白或者中和抗體，而完整的VP1能夠誘導(dǎo)較強(qiáng)烈的抗體反應(yīng)，但在接種106TCID50(半數(shù)組織感染量)的強(qiáng)毒48 h后不能有效抑制病毒粒子的復(fù)制。表達(dá)P1的核酸疫苗不僅能夠誘導(dǎo)較強(qiáng)烈的中和抗體，而且80%～100%的小鼠在接毒48 h后，血清中完全清除了病毒粒子。

隨著RNA干擾興起，編碼特異性沉默3 D和5’UTR(已證明兩者在FMDV復(fù)制過程中發(fā)揮重要作用)的sh RNA(短發(fā)夾RNA)，即3 D sh RNA。接種了3D sh RNA 18 h后，BHK-21細(xì)胞抑制102TCID50的強(qiáng)毒復(fù)制的能力增加了3倍。接種4～6周齡的豚鼠7 d后，80%的豚鼠能夠抵御103TCID50的 FMDV 強(qiáng)毒的攻擊［13］。

4 增強(qiáng)FMD核酸疫苗免疫原性的研究進(jìn)展

大量的研究證明單純的病毒表位誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)很弱，而且持續(xù)的時(shí)間很短，再加上核酸疫苗本身就有表達(dá)量低，免疫力較弱的缺點(diǎn)［14］，因此研究人員開始嘗試將衣殼蛋白編碼區(qū)與一些非編碼區(qū)基因或者是共刺激因子共同構(gòu)建于同一個(gè)質(zhì)粒載體中，試圖誘導(dǎo)更強(qiáng)更持久的免疫反應(yīng)。

Jong等［15］通過構(gòu)建包含 p1-2A/IL-1α (細(xì)胞介素-1α)和VP1/IL-1α同時(shí)加入人細(xì)胞巨化病毒內(nèi)部核糖進(jìn)入位點(diǎn)，通過免疫熒光和Western blotting確定了VP1或P1和IL-1α的表達(dá)。皮下接種小鼠后，檢測(cè)到IgG1和IgG2 A分子濃度都有很大的提高，證實(shí)了IL-1α對(duì)免疫誘導(dǎo)的增強(qiáng)作用。

Daniel等［16］構(gòu)建了包含F(xiàn)MDV P1-2A3 C3 D(2A、3 C、3D均為口蹄疫的非結(jié)構(gòu)蛋白，它們參與RNA的復(fù)制，多聚蛋白的裂解和結(jié)構(gòu)蛋白的折疊與裝配等過程)和GM-CSF(巨噬細(xì)胞集落刺激因子)的重組質(zhì)粒載體，通過皮下每2～3周加強(qiáng)一次 (共3次)免疫豬后發(fā)現(xiàn)構(gòu)建的核酸疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生了較高水平的FMDV中和抗體。

Lu Huijun等［17］構(gòu)建共表達(dá)P12 A-IL18-3 C的質(zhì)粒，然后加入化學(xué)佐劑左旋咪唑免疫豬，28 d后接種103TCID50的O型強(qiáng)毒，20 d后發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組的豬檢測(cè)到了高滴度的中和抗體和特異性抗體，并檢測(cè)到較高的T淋巴細(xì)胞和IFN-γ增殖率。

隨著研究的深入，相繼研制出了一些能有效改善核酸疫苗免疫應(yīng)答的佐劑制品，并運(yùn)用到FMD的核酸疫苗中來。如細(xì)胞因子，協(xié)同刺激分子以及補(bǔ)體。如IL-15、IL-2、IL-1β、IL-18、C3 d、CTLA4、PLGA(聚乳酸聚乙醇酸共聚物)等都用于構(gòu)建cDNA質(zhì)粒，且收到了較高的免疫反應(yīng)［18-21］。此外，Suk-Am 等［22］證明 FMDV 核酸 疫苗注入時(shí)采取電穿孔的方式要比基因槍或者其它方式產(chǎn)生的免疫反應(yīng)強(qiáng)烈。

5 展望

核酸疫苗在安全性、穩(wěn)定性、制備運(yùn)輸?shù)确矫婢哂衅渌呙鐭o法比擬的優(yōu)勢(shì)。目前隨著防疫標(biāo)準(zhǔn)的逐漸提高，口蹄疫傳統(tǒng)疫苗的局限性日益突出，核酸疫苗作為基因疫苗的代表，其必定能在未來的疫苗研究中扮演舉足輕重的角色。但對(duì)它的研究仍處于初級(jí)階段，還沒有商業(yè)化的核酸疫苗，且其致病機(jī)理依舊不是很清楚，免疫原性低，免疫耐受現(xiàn)象，及對(duì)基因安全性的困擾依舊需要科研人員進(jìn)行大量的研究。但是不可否認(rèn)的是，對(duì)DNA疫苗的探索，對(duì)口蹄疫的防治甚至整個(gè)畜牧業(yè)的健康發(fā)展都將帶來劃時(shí)代的意義。

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