中醫(yī)證候與基因、蛋白質(zhì)、代謝組學(xué)研究思路探討

朱明丹,杜武勛,姜 民,劉長玉,宋啟剛,魏 營

(1.天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院,天津 300193;2.天津南開大學(xué)藥學(xué)院,天津 300071)

證候?qū)嵸|(zhì)的研究一直是中醫(yī)學(xué)術(shù)界研究的熱點(diǎn)。幾十年來國家投入大量的人力和財力,但其研究并未取得突破性的成果,甚至陷入了矛盾和困惑的境地。近幾年來,基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)等現(xiàn)代科技的誕生似乎又給中醫(yī)證候?qū)W的研究帶來了新的曙光和前途。

1 中醫(yī)證候?qū)嵸|(zhì)研究的目的與思路的歷史回顧

中醫(yī)的 “證”是辨證論治的起點(diǎn)和核心。“證”是指在疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中,一組具有內(nèi)在聯(lián)系的、能夠反映疾病過程在某一階段的病機(jī),是機(jī)體對體內(nèi)外各種環(huán)境變化和致病因素作出反映的一種功能狀態(tài)。由于中醫(yī)的證候是通過望、聞、問、切四診所獲得的一組有相互關(guān)聯(lián)的癥狀和體征群的信息整理而得,缺乏客觀指征,臨床的把握上很大程度上依賴于醫(yī)生的診療水平。

為此,許多學(xué)者期望依賴現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)手段進(jìn)一步闡明證候?qū)嵸|(zhì)。在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的“實(shí)證主義”和“還原論”思想指導(dǎo)下,人們希望通過證候物質(zhì)基礎(chǔ)的尋找,找到證候的特異性指標(biāo),探索證候的高特異性和高靈敏性指標(biāo),試圖建立證候?qū)嶒?yàn)診斷單個金指標(biāo),從而實(shí)現(xiàn)證候的微觀辨證依據(jù)。研究者不斷從不同角度及層次研究與“證”相關(guān)的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)。隨著“證”本質(zhì)研究的廣泛深入開展,某些指標(biāo)的特異性逐漸被否定,甚至許多觀察指標(biāo)出現(xiàn)了相矛盾的結(jié)果[1]。因此,人們看到現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)指標(biāo)及單系統(tǒng)、單層次的研究已經(jīng)難以全面揭示證候的科學(xué)內(nèi)涵。

20世紀(jì)中葉以來,人類基因組學(xué)研究的方法和內(nèi)容與中醫(yī)學(xué)整體觀、辨證觀有許多相似之處。國家中醫(yī)藥管理局在中醫(yī)現(xiàn)代化科技發(fā)展戰(zhàn)略研究中,制訂了證候研究的科研思路,其中提出了證候與蛋白質(zhì)組學(xué)的研究。其理論依據(jù)是,“真核細(xì)胞生物基因功能復(fù)雜,但基因總要表達(dá)為相應(yīng)的蛋白質(zhì)才能產(chǎn)生生物功能,而且一般情況下,基因組只表達(dá)一部分基因,其表達(dá)類型均受到生存環(huán)境及內(nèi)在狀態(tài)變化的影響而有較大差異。因此采用對一個基因組的全套蛋白質(zhì),一個細(xì)胞乃至一個組織的全套蛋白質(zhì)的蛋白組學(xué)研究方法進(jìn)行證候研究具有更重要的意義”。國家自然科學(xué)基金 2006年中醫(yī)藥重大研究計劃招標(biāo)指南指出:“證候與疾病和方劑的相關(guān)性理論是中醫(yī)基礎(chǔ)理論建立的最根本問題”,圍繞疾病證候病機(jī)和方劑的相關(guān)性這一中醫(yī)證候研究的重要科學(xué)問題,突出中醫(yī)學(xué)思維特征與現(xiàn)代科學(xué)設(shè)計融合的研究思路,以方劑干預(yù)的治療效果作為參照標(biāo)準(zhǔn),用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)為研究手段,基于中醫(yī)以方測證的逆向思維的認(rèn)“證”方法,不斷積累、完善,應(yīng)能從蛋白水平上找到方證相應(yīng)理論的物質(zhì)基礎(chǔ)以及解決“證”本質(zhì)問題,構(gòu)建出具有堅實(shí)臨床科學(xué)基礎(chǔ)的證候標(biāo)準(zhǔn)。

因此,近年來有學(xué)者提出利用基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)研究中醫(yī)證候的設(shè)想,并提出“證候基因組學(xué)”、“證候蛋白質(zhì)組學(xué)”等概念,試圖在分子水平描繪中醫(yī)證候本質(zhì)的全貌。就分子水平而言,證候不一,基因表達(dá)譜也不一樣,“證”的本質(zhì)是基因型及其表達(dá),體外能用肉眼觀察到的癥狀和體征變化具有其分子基礎(chǔ),是基因及其在 mRNA、蛋白質(zhì)水平差異的外在表現(xiàn),結(jié)合臨床辨證分型,提出證候基因組學(xué)、證候蛋白質(zhì)組學(xué)理論,提倡通過分子流行病學(xué)調(diào)查,綜合 mRNA、蛋白質(zhì)等多種分子生物學(xué)標(biāo)志物,引入分子生物學(xué)方法、蛋白質(zhì)組學(xué)方法。如 mRNA差異顯示法、差異二維蛋白質(zhì)電泳方法,從 mRNA、蛋白質(zhì)水平探討中醫(yī)“證”的實(shí)質(zhì)、證的分類、證的辨治、證的演變規(guī)律,闡明證的基因表型、蛋白質(zhì)表形及其轉(zhuǎn)化[2]。通過對正常及病變樣本蛋白質(zhì)組分差異的比較和相同疾病不同證型之間的比較,就有可能從整體上發(fā)現(xiàn)某些疾病或同病異證的特有蛋白質(zhì)的表達(dá),建立蛋白質(zhì)多態(tài)性與疾病中醫(yī)分型、辨證用藥之間的系統(tǒng)的有規(guī)律的聯(lián)系,在復(fù)雜的多種致病因素作用下找到證候的共同本質(zhì)[3]。

中醫(yī)證候?qū)嵸|(zhì)的研究,其目的就是要用現(xiàn)代醫(yī)學(xué)理論揭示中醫(yī)證理論中蘊(yùn)藏的科學(xué)內(nèi)涵,闡明中醫(yī)診斷和治療各種證及其相關(guān)疾病的微觀機(jī)制,學(xué)者們希望用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的手段,找到中醫(yī)證候的物質(zhì)基礎(chǔ),以期闡明證候的科學(xué)內(nèi)涵,期望如現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對某病的診斷一樣,找到客觀的指標(biāo)。

2 冠心病中醫(yī)證候與基因、蛋白質(zhì)、代謝組學(xué)研究的現(xiàn)狀

基因、蛋白質(zhì)、代謝組學(xué)研究,給證候的進(jìn)一步研究帶來更多機(jī)遇與啟示,但能否全面詮釋證候的本質(zhì),沿著這一研究的目的和研究思路,我們最終能走到何處。為了達(dá)到科學(xué)研究的目的,必須有達(dá)到目的的正確的方法和手段,在這一研究過程中我們必須審視我們的研究思路。以冠心病為例,綜合目前的研究需要我們冷靜思考。

綜觀目前在冠心病證候?qū)W研究方面,許多學(xué)者進(jìn)行了有益的探索。朱萱萱[4]等研究冠心病患者與健康人以及冠心病患者之間在代謝組學(xué)方面存在的差異。男性的 score plot圖中,健康對照組、氣虛血瘀證和痰阻心脈證相應(yīng)集中在 3個不同區(qū)域,完全沒有重疊,區(qū)分度很高。女性的 score plot圖中,健康對照組、氣虛血瘀證、痰阻心脈證和氣陰兩虛證相應(yīng)集中在 4個不同區(qū)域,基本沒有重疊,區(qū)分度也很高,提示代謝組學(xué)方法可能成為冠心病的病因病機(jī)以及中醫(yī)辨證分型新的研究手段。劉衛(wèi)紅[5]等運(yùn)用代謝組學(xué)技術(shù),動態(tài)觀察高脂血癥向動脈粥樣硬化發(fā)展過程中“由痰致瘀”的生化物質(zhì)基礎(chǔ)。高脂血癥前期以脂質(zhì)代謝紊亂為特點(diǎn),即高脂血癥痰濁的生化物質(zhì)基礎(chǔ),隨著病程進(jìn)展,乙酰糖蛋白尤其是 O-乙酰糖蛋白的出現(xiàn),說明凝血機(jī)制出現(xiàn)異常。由于參與血液凝固過程的纖維蛋白原、凝血酶原和幾種凝血因子都是糖蛋白,因此乙酰糖蛋白譜峰的改變可能是高脂血癥大鼠模型血瘀的早期生物標(biāo)記物。同時脂肪產(chǎn)生熱量供機(jī)體活動的需要時,脂肪分解產(chǎn)生酮體及能量代謝產(chǎn)生大量乳酸,使脂質(zhì)代謝紊亂進(jìn)一步加重,這與同時檢測的血脂、血流變結(jié)果相一致。分析這些內(nèi)源性代謝產(chǎn)物的形成、轉(zhuǎn)移機(jī)制和過程,可提示痰瘀證候的動態(tài)演變、時相特點(diǎn)和由痰致瘀的條件,從而揭示其生物學(xué)本質(zhì)。吳紅金[6]等采集正常健康者、冠心病心血瘀阻證病人的血漿,用雙向電泳、圖像分析技術(shù)發(fā)現(xiàn),冠心病血瘀證病人血漿與正常相比有 3個蛋白質(zhì)下調(diào)和 6個蛋白質(zhì)上調(diào),用膠內(nèi)酶切提取蛋白進(jìn)行質(zhì)譜鑒定,其中冠心病血瘀證病人血漿與正常相比升高的蛋白質(zhì)有免疫球蛋白、纖維蛋白原、粒酶,與正常相比降低的蛋白有 CD44SP,而這些蛋白有望發(fā)展成為冠心病血瘀證病人血漿中的診斷標(biāo)志物。趙慧輝[7]等采用 DIGE差異凝膠電泳和串聯(lián)質(zhì)譜對 8例冠心病不穩(wěn)定性心絞痛血瘀證患者血瘀證程度變化前后及健康人的血漿進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)的比較研究。初步發(fā)現(xiàn),Clusterin、ApoA-I在冠心病不穩(wěn)定性心絞痛血瘀證患者的血漿中,表達(dá)低于健康人,血瘀證程度變輕后表達(dá)增加。而 Fibrinogenβchain、VitaminD-Binding Protein、Haptoglobinβchain、Haptoglobinα2 chain在冠心病不穩(wěn)定性心絞痛血瘀證患者的血漿中,表達(dá)高于健康人,血瘀證程度變輕后表達(dá)降低。認(rèn)為Clusterin、ApoA-I、Fibrinogenβchain、Vitamin DBinding Protein、Haptoglobinβchain、Haptoglobinα2 chain可能與冠心病不穩(wěn)定性心絞痛血瘀證相關(guān)。

另一方面,冠心病辨證分型目前沒有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn),更何況王曉才等研究冠心病證候組合以三證組合最為多見,兩證組合多為氣虛血瘀證,三證組合多為氣虛血瘀證合并陰虛證或痰濁證或陽虛證,四證組合多氣虛血瘀陽虛證合并陰虛證或痰濁證或寒凝證,五證組合為氣虛血瘀陽虛寒凝證合并陰虛證或痰濁證[8]。如此復(fù)雜的證候組合,并且許多中醫(yī)的證候是根據(jù)中醫(yī)理論,從理論推演而來,如氣虛,有氣虛下陷,宗氣下陷,大氣下陷等;又有腎不納氣等不同概念,又可分為肝氣、脾氣、心氣、肺氣,腎氣等。并且血瘀證又結(jié)合臟腑有心血瘀,肝血瘀證等。

3 中醫(yī)證候與基因、蛋白質(zhì)、代謝組學(xué)研究的審視和思考

通過以上有關(guān)證候與基因、蛋白質(zhì)、代謝組學(xué)研究情況的分析不難看出,雖然基因、蛋白質(zhì)、代謝組學(xué)是從整體上研究疾病發(fā)生的機(jī)制,解決了以往研究的單一組織、單一器官、單一系統(tǒng)的研究方法,但是所采取的研究思路仍是還原分析方法研究證候概念,以尋找證候特異物質(zhì)為目標(biāo),甚至是基因和蛋白質(zhì)為指標(biāo)。但據(jù)此法研究中醫(yī)證候,可能又回到以往的老路,陷入以往還原分析方法的泥潭,以至于可能毫無功效。

中醫(yī)的證候是根據(jù)中醫(yī)理論推演而來,而在目前所進(jìn)行的的研究中中醫(yī)分型的標(biāo)準(zhǔn)不一,又加之證候組合復(fù)雜,無法就研究結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)一分析。

情志致病和心理因素在中醫(yī)的證候?qū)W形成中占有重要位置。目前基因的結(jié)構(gòu)和功能還難以闡明,諸如感覺、思維、意識等高級神經(jīng)活動的機(jī)制。因此,單純的基因、蛋白質(zhì)、代謝組學(xué)對人的本質(zhì)、證候本質(zhì)的闡述都是不全面的[9]。

許多學(xué)者提出了證候研究應(yīng)注意到病證結(jié)合研究。在證候本質(zhì)研究中,證候受病的制約,證候與病之間呈交織網(wǎng)絡(luò)的關(guān)系,即一證可見于多種疾病之中,一種疾病又可見若干證型。由于現(xiàn)代科學(xué)的發(fā)展,對疾病的認(rèn)識也越來越深入,中醫(yī)研究者也趨向于采用病證結(jié)合的模式進(jìn)行研究,這樣更容易使中醫(yī)與現(xiàn)代科學(xué)找到契合點(diǎn)。所以我們應(yīng)嚴(yán)格確立疾病的納入、排除標(biāo)準(zhǔn),使疾病單純化[10];嚴(yán)格確立方劑的適應(yīng)證,即證候納入的辨證標(biāo)準(zhǔn),嚴(yán)格篩選病例,為此證候規(guī)范化是實(shí)現(xiàn)中醫(yī)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化和現(xiàn)代化的重要步驟,建立規(guī)范化的證候診斷標(biāo)準(zhǔn)是證候深入研究和多中心協(xié)作研究的前提和基礎(chǔ)。

采用方證相關(guān)的研究方法,認(rèn)為方證相關(guān)強(qiáng)調(diào)了方劑與其作用對象之間的相互作用,即方劑的功用是特定方藥與其作用對象特定證之間相互作用的結(jié)果。方證相關(guān)也提示從單一角度對方或?qū)ψC的研究,有可能背離中醫(yī)學(xué)術(shù)的內(nèi)在邏輯,而將方與證結(jié)合起來考慮則可大大提高研究效度[11]。并且提出了動態(tài)研究等的研究中應(yīng)該注意的問題。但是中醫(yī)證候的復(fù)雜性表明,對于證候的研究不能單純使用西醫(yī)學(xué)的手段和方法,證候與致病因素之間、與理化指標(biāo)之間、與方劑效應(yīng)之間都存在著非線性關(guān)系,這些非線性關(guān)系是導(dǎo)致多年來證候研究出現(xiàn)矛盾和困惑的根源。證候的定位是整體性和亞整體性的,從系統(tǒng)論角度而言,是機(jī)體系統(tǒng)質(zhì)和功能子系統(tǒng)異常的外在表現(xiàn),證候偏重于功能失調(diào),是對機(jī)體整體功能反應(yīng)狀態(tài)的認(rèn)識和把握[12]。

“證候是人體這個復(fù)雜巨系統(tǒng)在病理狀態(tài)下的整體反應(yīng)”,根據(jù)復(fù)雜系統(tǒng)的認(rèn)識:復(fù)雜系統(tǒng)是由眾多存在復(fù)雜相互作用的組分(或子系統(tǒng))組成的,系統(tǒng)的整體行為(功能或特性)不能由其組分的行為(功能或特征)來獲得。因此在證候與基因、蛋白質(zhì)、代謝組學(xué)研究過程中,應(yīng)該結(jié)合復(fù)雜系統(tǒng)的研究方法和思維,更應(yīng)該認(rèn)識到證候?qū)W研究需要我們正確的研究思路和研究的方法。

當(dāng)研究的外部干預(yù)系統(tǒng)相對簡單時,例如西藥,可以歸納為擾動點(diǎn),相當(dāng)于“點(diǎn)”對“系統(tǒng)”的作用。但是當(dāng)研究的外部干預(yù)系統(tǒng)本身是一個復(fù)雜系統(tǒng)時,例如中醫(yī)方劑,現(xiàn)有的系統(tǒng)生物學(xué)尚不能與方證結(jié)合的整體化研究相適應(yīng)。因此我們不僅要在中醫(yī)藥研究中應(yīng)用系統(tǒng)生物學(xué),而且要源于系統(tǒng)生物學(xué)和中醫(yī)藥學(xué)進(jìn)行創(chuàng)新和提升,發(fā)展高于現(xiàn)有系統(tǒng)生物學(xué)、適合兩個復(fù)雜系統(tǒng)相互作用研究的整體化方案,這也將反過來推動系統(tǒng)生物學(xué)和生命科學(xué)方法學(xué)的發(fā)展[13]。

系統(tǒng)生物學(xué)的研究思路和方法雖然與中醫(yī)學(xué)的整體觀和辨證論治有著許多的相似,但是采用拿來主義的方法和手段研究復(fù)雜的中醫(yī)證候?qū)W問題,我們認(rèn)為是值得我們冷靜思考的,組學(xué)在中醫(yī)研究中前景看好,但同時也面臨許多問題和挑戰(zhàn)。正是由于證候和中藥的復(fù)雜性、整體性、動態(tài)性和異病同證、同病異證等特性,再加上由于種族、體質(zhì)、飲食習(xí)慣、氣候、地理環(huán)境、年齡、性別乃至患者的心理狀況等諸因素也會影響證候表現(xiàn)的差異。因此,盡管病因、病位、病性基本相同,相同的證候又會表現(xiàn)出不同的亞型,又大大增加了證候組學(xué)研究的復(fù)雜性。

證候信息多具有模糊性和不確定性,應(yīng)屬于復(fù)雜巨系統(tǒng)范疇。單純用直觀、線性的方法研究證候,已不能適應(yīng)中醫(yī)證候研究的需要。復(fù)雜性科學(xué)、模糊數(shù)學(xué)、集對分析和計算機(jī)技術(shù)的發(fā)展給處理以定性描述為主的、動態(tài)不確定的信息——證候的內(nèi)涵及其本質(zhì)提供了可能。從復(fù)雜性科學(xué)角度研究中醫(yī)藥是近年來在中醫(yī)學(xué)界興起的新的研究熱點(diǎn),中醫(yī)藥研究中引入復(fù)雜性科學(xué)研究、非線性科學(xué)研究方法,它將對中醫(yī)藥的研究提供新的思路和方法,促進(jìn)中醫(yī)藥研究的深入發(fā)展[14]。

我們必須對“證候?qū)嵸|(zhì)”研究、證候物質(zhì)基礎(chǔ)研究的方向和目的進(jìn)行深刻的理解和認(rèn)識,只有吸收與創(chuàng)新,在中醫(yī)理論特別是中醫(yī)整體觀指導(dǎo)下,運(yùn)用現(xiàn)代科技思路、方法和手段,創(chuàng)新性地提升我們的研究的方法和思路。

[1]吳元勝,朱華宇,儇國維,等.證候研究是實(shí)驗(yàn)中醫(yī)現(xiàn)代化的必由之路[J].中醫(yī)藥學(xué)刊,2003,12(8):1296-1298.

[2]陳葦菁,廖榮鑫,游章才,等.中醫(yī)證候?qū)W與蛋 白組學(xué)探析[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生,2007,23(14):2148-2149.

[3]劉曉燕,呂志平,張緒富,等.蛋白質(zhì)組及其在現(xiàn)代中醫(yī)研究中的應(yīng)用[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志,2003,23(2):84-87.

[4]朱萱萱,王廣基,阿基業(yè),等.冠心病中醫(yī)辨證分型的代謝組學(xué)研究[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2009,27(6):1267-1269.

[5]劉衛(wèi)紅,張琪,顏賢忠,等.高脂血癥及動脈粥樣硬化痰瘀演變的代謝組學(xué)研究[J].中醫(yī)雜志,2008,49(8):738-741.

[6]吳紅金,馬增春,高月,等.蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對冠心病血瘀證相關(guān)蛋白的研究[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志,2005,3(3):189-20.

[7]趙慧輝,郭淑貞,侯娜,等.差異凝膠電泳技術(shù)尋找冠心病心絞痛血瘀證的相關(guān)蛋白[J].中華中醫(yī)藥雜志(原中國醫(yī)藥學(xué)報),2008,23(12):1050-1063.

[8]王曉才,農(nóng)一兵,林謙,等.138例冠心病患者的證候分布與組合特點(diǎn)分析[J].中醫(yī)雜志,2008,49(1):62-63,66.

[9]朱姝,高榮林,隋殿軍,等.基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)與證候?qū)嵸|(zhì)[J].中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志,2002,8(12):19-20.

[10]李喜悅,張文生,王永炎.蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在方證相關(guān)理論研究中的應(yīng)用探討[J].中醫(yī)研究,2007,20(3):1-2.

[11]李喜悅,張文生,王永炎.蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在方證相關(guān)理論研究中的應(yīng)用探討[J].中醫(yī)研究,2007,20(3):1-2.

[12]郭蕾,王永炎,等.關(guān)于證候因素的討論[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志,2004,24(7):643-644.

[13]羅國安,梁瓊麟,劉清飛,等.整合化學(xué)物質(zhì)組學(xué)的整體系統(tǒng)生物學(xué)——中藥復(fù)方配伍和作用機(jī)理研究的整體方法論[J].世界科學(xué)技術(shù)——中醫(yī)藥現(xiàn)代化,2007,9(1):10-15.

[14]王永炎.完善辨證方法體系的建議[J].中國天津第四屆國際中醫(yī)藥學(xué)術(shù)交流會議論文集,2004.325.