牛膝應(yīng)用于大鼠同種異體肢體移植抗排斥反應(yīng)的研究

馮磊 張震宇 谷文光

(1.齊齊哈爾市第一醫(yī)院 黑龍江齊齊哈爾 161000; 2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 黑龍江哈爾濱 150000)

牛膝具有明顯的免疫抑制作用,已被廣泛認(rèn)可,但其發(fā)揮免疫抑制功能的作用機(jī)制,并為完全明了,有大量實(shí)驗(yàn)研究表明,牛膝抗排斥反應(yīng)的作用途徑是多方面、多角度的。在免疫細(xì)胞水平的抑制作用,可明顯抑制T、B淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)功能,對(duì)巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞都有一定抑制作用。在免疫分子水平的抑制作用,通過(guò)抑制IL～2、IL～6的分泌,從而對(duì)細(xì)胞毒T細(xì)胞的產(chǎn)生和成熟形成有一定的抑制作用,影響其對(duì)靶細(xì)胞的殺傷能力。其他途徑,可以抑制細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞的功能,減弱其釋放穿孔素和顆粒酶B的表達(dá)能力,從而影響CTL細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷。

1 資料與方法

1.1 一般資料

受供者分別為10～12周齡清潔及純系健康雄性Wistar大鼠、SD大鼠,體重200～250g,購(gòu)自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心和北京維通利華公司,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均在清潔級(jí)條件下喂養(yǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

牛膝水提取物的制備由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥劑局協(xié)助完成。將牛膝粉碎后加雙蒸水浸泡,煮沸3次,合并3次藥液放入4℃冰箱中過(guò)夜,以3000r/min 離心30min取上清液用雙蒸水稀釋。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

雄性Wistar大鼠及雄性SD大鼠各27只。隨機(jī)分成3組,每組各9只。SD大鼠為受體,Wistar大鼠為供體。實(shí)驗(yàn)分為3組,每組9只。移植肢體術(shù)后2d內(nèi)死亡的認(rèn)為發(fā)生手術(shù)并發(fā)癥,不進(jìn)入實(shí)驗(yàn)觀察,另行手術(shù)補(bǔ)充。A組(牛膝組):將牛膝水化稀釋為0.25g/mL,術(shù)后術(shù)后當(dāng)日起每隔1d天灌服1次,劑量為5mg/kg。B組(對(duì)照組):術(shù)后不用免疫抑制劑,僅應(yīng)用生理鹽水10mL/kg·d-1灌服。C組(環(huán)孢素A,CsA)組:術(shù)后將CsA用生理鹽水稀釋為1mg/mL,術(shù)后當(dāng)日起每隔1d灌服1次,劑量為5mg/kg。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)

1.4.1 一般指標(biāo) 觀察項(xiàng)目包括大鼠的活躍程度、飲食、大小便、生命體征、皮膚、體毛、傷口有無(wú)分泌物、紅腫;移植物的血循、顏色、溫度、腫脹程度、體毛的變化、皮膚水皰、滲出、潰瘍、糜爛、焦痂、足趾變黑壞死等,詳細(xì)記錄各種變化的時(shí)間及情況。

1.4.2 急性排斥反應(yīng)的觀測(cè) 根據(jù)異體移植肢體的血運(yùn)變化和皮膚表現(xiàn),觀察各組移植肢體急性排斥反應(yīng)的發(fā)生時(shí)間和移植肢體存活時(shí)間,其中急性排斥反應(yīng)的發(fā)生時(shí)間嚴(yán)格限定在移植肢體皮膚出現(xiàn)紅斑水腫持續(xù)24h,移植肢體壞死標(biāo)準(zhǔn)為皮膚脫落或出現(xiàn)干性壞疽。

1.4.3 移植肢體組織的光鏡標(biāo)本制備及觀察 于術(shù)后1、3、5、7d切取異體移植肢體包括皮膚、脛前肌、骨、坐骨神經(jīng)、脛前血管的組織塊,消毒縫合切口。用10%甲醛固定,常規(guī)方法制備樣本。

2 病理學(xué)診斷和分級(jí)

并根據(jù)Lee和Buttermeyer推薦的移植物排斥反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分級(jí)0級(jí)為無(wú)排斥,各組織正常,無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn);I級(jí)為輕度排斥,血管周?chē)肮趋兰￠g質(zhì)內(nèi)局灶性炎性細(xì)胞浸潤(rùn),皮膚基底層細(xì)胞空泡化;II級(jí)為中度排斥,血管周?chē)肮趋兰￠g質(zhì)內(nèi)多灶性炎性細(xì)胞浸潤(rùn),皮膚上基底層細(xì)胞大泡形成;III級(jí)為重度排斥,彌漫性多類型炎性細(xì)胞浸潤(rùn),伴有各組織明顯的出血、水腫、脈管炎、壞死或纖維化。因?yàn)槠つw的排斥反應(yīng)最強(qiáng),所以本實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)每組皮膚排斥反應(yīng)的病理學(xué)分級(jí)平均值。CD4+、CD8+細(xì)胞檢測(cè)術(shù)后對(duì)各組模型行鼠尾取血,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)T淋巴細(xì)胞亞群中CD4+、CD8+細(xì)胞的百分率及CD4+/CD8+的比值。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析,進(jìn)一步多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

大鼠一般于手術(shù)后逐漸清醒,起初精神狀況較差,但可以飲水、行走、恢復(fù)大小便,術(shù)后當(dāng)日基本上可以進(jìn)食。1d后宿主的精神狀況、飲食、大小便、生命體征基本恢復(fù)正常。

通過(guò)術(shù)后連續(xù)觀察發(fā)現(xiàn),A、B組大鼠術(shù)后1～2d移植肢體皮溫較健側(cè)肢體稍高,移植物腫脹較輕,血運(yùn)良好。術(shù)后3～4d開(kāi)始,移植物開(kāi)始腫脹,先是移植物的上端和足背部,然后迅速加重和擴(kuò)展,5～6d左右皮膚變濕,7～8d左右肢體毛發(fā)開(kāi)始脫落,皮膚出現(xiàn)紅斑并伴糜爛以大腿的內(nèi)上側(cè)出現(xiàn)最早,9～13d整個(gè)移植物變黑壞死。C組大鼠術(shù)后移植肢體也輕度腫脹,于術(shù)后8～9d天腫脹開(kāi)始明顯,最終于14～19d移植物變黑壞死。A組排斥反應(yīng)時(shí)間(9.62±2.37),肢體平均存活時(shí)間（16.11±1.72）;B組排斥反應(yīng)時(shí)間(7.13±1.37),肢體平均存活時(shí)間(11.14±1.31);C組排斥反應(yīng)時(shí)間(13.71±2.48),肢體平均存活時(shí)間(21.32±1.53)。

5 討論

同種異體移植排斥反應(yīng)的本質(zhì)就是免疫應(yīng)答過(guò)程,都要經(jīng)過(guò)抗原識(shí)別、免疫細(xì)胞活化分化和效應(yīng)階段[1]。有結(jié)果顯示,同種異體移植排斥反應(yīng)和常規(guī)免疫應(yīng)答的不同之處主要在于抗原識(shí)別和效應(yīng)階段。同種異體組織器官移植后,發(fā)生急性排斥反應(yīng)時(shí)CD4+T細(xì)胞升高,CD8+細(xì)胞下降及CD4+/CD8+的比值升高。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用牛膝后,CD4+、CD4+/CD8+的比值明顯降低,CD8+明顯增高,有延長(zhǎng)移植物存活時(shí)間和動(dòng)物模型存活時(shí)間的作用,有力的證實(shí)了牛膝具有明顯抑制排斥反應(yīng)的作用。綜上所述,大量實(shí)驗(yàn)已證明牛膝在抗排斥反應(yīng)有明顯的作用,但其具體明確的抑制途徑和副作用,還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究證實(shí),盡管需要解決的問(wèn)題不少,但我們相信,隨著各種相關(guān)研究的深入,中藥免疫抑制劑的基礎(chǔ)研究,以及未來(lái)的臨床應(yīng)用將會(huì)有廣闊的前景,因此,隨著實(shí)驗(yàn)技術(shù)的提高,中藥免疫抑制劑作用機(jī)制會(huì)得到充分的揭示。相信不久的將來(lái)中藥免疫抑制劑在臨床的應(yīng)用將造福于人類。

[1]陳宗鍇,李電東.牛膝多糖的免疫調(diào)節(jié)作用[J].藥學(xué)學(xué)報(bào),1997,32(12):881～887.