脊髓損傷動物模型的建立及其評價

田偉,張焱,孫嵐,王征美

脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)是一種致殘率很高的疾病,給家庭、社會均帶來沉重的負(fù)擔(dān)。隨著工業(yè)、建筑業(yè)和交通運(yùn)輸?shù)娘w速發(fā)展,脊髓損傷患者數(shù)量呈逐年上升趨勢。由于脊髓是神經(jīng)功能的中間通路,脊髓損傷可以直接導(dǎo)致神經(jīng)功能損傷,從而引起組織、器官功能障礙。傳統(tǒng)觀念認(rèn)為,哺乳動物的脊髓損傷后不能再生,導(dǎo)致其后期功能恢復(fù)的預(yù)后較差。近年來實(shí)驗(yàn)研究證實(shí),中樞神經(jīng)損傷后具有一定的再生能力。建立一種可靠性高、重復(fù)性好的動物模型,對研究脊髓損傷具有十分重要的理論價值和臨床意義。

1 動物的選擇

選擇實(shí)驗(yàn)動物主要考慮兩個方面的因素:其生物學(xué)特點(diǎn)是否接近人類;實(shí)驗(yàn)動物的來源及其價格狀況。

從解剖生理上講,進(jìn)行脊髓損傷研究最理想的實(shí)驗(yàn)動物是靈長類動物,如猿、猩猩、猴等,因?yàn)樵绞歉叩葎游锶绻?、猴等動?越接近人類,就越容易和可靠地觀察脊髓損傷的功能改變,即行為學(xué)變化及其恢復(fù)情況;且這類動物不僅體型大,在手術(shù)操作實(shí)感上也與人極為相似。但其價格昂貴,難以獲得,因而難被推廣使用。目前我國脊髓損傷實(shí)驗(yàn)研究最常選用的動物是大白鼠,因?yàn)樗鼈兙哂谐杀镜汀⒎N系內(nèi)純合性好、基因?qū)W和生理特性較接近人類,且具有較強(qiáng)的抗感染能力和生命力,便于管理的特點(diǎn);選用品質(zhì)純正的大鼠,適用于電生理和單克隆抗體、原位雜交反應(yīng)、轉(zhuǎn)基因、基因失效等基因工程和分子生物學(xué)研究,且價格經(jīng)濟(jì);其他依次是兔、貓、犬。這些動物高級神經(jīng)系統(tǒng)較發(fā)達(dá),且價格相對便宜,較易獲得。

2 復(fù)制脊髓損傷模型的要求

研究脊髓損傷最基本的條件是建立標(biāo)準(zhǔn)、理想的脊髓損傷模型。早在1911年,Allen曾用重物撞擊法首次在實(shí)驗(yàn)動物身上復(fù)制出脊髓損傷模型。此后隨著對脊髓損傷研究的不斷深入,國內(nèi)外學(xué)者不斷設(shè)計出各種各樣的脊髓損傷模型。理想的模型應(yīng)符合以下要求。

2.1 臨床相似性 即脊髓損傷模型的制作過程與臨床脊髓損傷過程相近似,動物的手術(shù)創(chuàng)傷盡可能少。臨床上脊髓損傷的致傷因素很多,因此脊髓損傷的研究需要設(shè)計出各種各樣與之相適應(yīng)的模型,如設(shè)計靜壓型脊髓損傷模型以研究骨折碎片、脫出椎間盤或占位病變對脊髓的壓迫損傷;設(shè)計牽張性脊髓損傷模型,用以研究脊柱矯形器的過度撐開作用所致的脊髓牽張性損傷等。

2.2 可調(diào)控性 即損傷程度可自由控制,用同一方法不同程度的致傷量作用動物脊髓同一節(jié)段產(chǎn)生不同程度的脊髓損傷,致傷量大小與脊髓損傷程度成線性關(guān)系,以便復(fù)制出不同損傷程度的脊髓損傷模型。

2.3 可重復(fù)性 即對脊髓損傷模型制作的關(guān)鍵步驟客觀化、定量化,模型制備時操作技術(shù)簡單,重復(fù)性好,易于掌握,便于推廣。

2.4 可操作性 操作簡單,即所用設(shè)備要求不高,操作不繁瑣,能快速大批制作。死亡率低,并發(fā)癥少。脊髓損傷后實(shí)驗(yàn)動物的死亡率常高于15%,同時脊髓損傷并發(fā)癥多,嚴(yán)重影響了實(shí)驗(yàn)結(jié)果,因此,降低死亡率,減少并發(fā)癥也是脊髓損傷動物模型制作的關(guān)鍵。

3 脊髓損傷動物模型制備

針對不同的臨床問題,可選擇不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?動物模型的選擇對研究結(jié)果具有重要的影響。

3.1 脊髓撞擊傷模型 脊髓撞擊傷模型是通過用重物撞擊脊髓造成脊髓損傷而制成的脊髓損傷動物模型,最早由Allen創(chuàng)建,以一個有刻度的套管確定重物墜落高度,自由下落,打擊置于脊髓上的擊板而間接打擊脊髓,造成損傷。此方法簡單易行,易于復(fù)制,與人類脊髓損傷發(fā)生相近。通過調(diào)整重錘的重量和撞擊高度可改變撞擊能量;也可通過調(diào)整打擊板的大小、形狀等來調(diào)整撞擊的部位和范圍。由于不打開硬脊膜,可防止結(jié)締組織或其他外來成份侵入損傷脊髓。該模型較為接近人類脊髓損傷的病理生理特點(diǎn)及變化規(guī)律:早期組織水腫、出血、壞死,隨后階段性部分修復(fù)、組織重建,最后慢性壞死囊腔形成、實(shí)質(zhì)細(xì)胞萎縮、膠質(zhì)瘢痕形成,其組織損傷的時空效應(yīng)與人類脊髓損傷有較好的一致性。因此,該模型可用于脊髓損傷的病理生理機(jī)制和實(shí)驗(yàn)性治療研究,是目前與臨床脊髓損傷相關(guān)性較好的一種模型。

其缺點(diǎn)是:重物打擊的瞬間,脊柱脊髓的偏移常常造成致傷結(jié)果的不一致性,而且同樣的勢能造成的損傷程度往往相差很大。為了減少模型間差異,Gruner在Allen基礎(chǔ)上創(chuàng)造了Now York University碰撞器[1],其優(yōu)點(diǎn)在于能夠監(jiān)控?fù)p傷參數(shù),如碰撞速度和組織位移,使制作的模型更加符合預(yù)設(shè)標(biāo)準(zhǔn),減少損傷多樣性,是一種標(biāo)準(zhǔn)化的制作脊髓損傷模型的儀器,已被脊髓損傷研究者廣泛應(yīng)用。盡管如此,該模型僅僅模擬致傷時的最初打擊狀態(tài),忽略了持續(xù)性的擠壓作用;而在人類急性脊髓損傷往往因脊柱骨折存在著持續(xù)性的擠壓作用。

3.2 脊髓壓迫傷模型 脊髓壓迫是導(dǎo)致脊髓損傷的重要原因之一。該損傷模型主要為模擬椎管內(nèi)占位性病變造成的脊髓損傷?？煞譃榧毙詨浩葌吐詨浩葌?。壓迫方法一般是通過異物植入的方式,如植入膨脹的球囊、不銹鋼螺釘、腫瘤細(xì)胞、硅膠片等。急性壓迫的病理生理過程與脊髓撞擊模型較為相似;但慢性脊髓壓迫為非瞬間損傷,便于進(jìn)行神經(jīng)功能和代謝改變的檢測。

球囊壓迫方法最早于1953年由Tadov等[2]應(yīng)用:將一個可膨脹的氣球放入椎骨與硬脊膜之間,以不同速率向氣球充氣使其膨脹,導(dǎo)致不同程度的脊髓損傷。此方法可在脊髓任何部位致傷,球囊氣體注入量或壓迫時間可任意選擇,操作方法簡便,實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性好。此模型常用于撞擊與壓迫對脊髓損傷機(jī)制的對比研究。在Tadov之后,Seijun等應(yīng)用球囊式導(dǎo)管經(jīng)過椎間孔置入L1水平的硬膜外隙,然后注入生理鹽水,根據(jù)注入生理鹽水量的不同,即可造成輕度、中度、重度的脊髓損傷模型[3]。田偉等將帶有金屬絲的硅膠片通過黃韌帶植入椎管中,造成脊髓壓迫模型[4],該方法不用打開椎板,這樣既可以減少手術(shù)創(chuàng)傷又可以簡化操作,不但可以準(zhǔn)確定位,而且手術(shù)重復(fù)性好,死亡率低,模型較均一。這幾種方法的特點(diǎn)在于植入異物首先造成的是一個急性壓迫,其后才是持續(xù)的慢性壓迫,這與臨床急性椎間盤突出、脫出造成脊髓受壓的病理過程較為相似。

不銹鋼螺釘壓迫脊髓,1990年由Hashimoto應(yīng)用于大鼠T11水平脊髓,為漸進(jìn)型脊髓壓迫所致脊髓損傷提供了一個實(shí)用且簡單的模型。河南醫(yī)科大學(xué)孔抗美等將此模型進(jìn)行改進(jìn),后路安裝有機(jī)玻璃平板固定的不銹鋼螺釘壓迫裝置,造成漸進(jìn)型脊髓受壓模型[5]。該模型雖能較好地模擬慢性壓迫的自然進(jìn)程,但增加了手術(shù)次數(shù)和創(chuàng)傷。

Uchida等利用轉(zhuǎn)基因的小鼠作為慢性壓迫性頸髓損傷模型來對脊髓壓迫性疾病進(jìn)行研究,培養(yǎng)出的轉(zhuǎn)基因小鼠隨著年齡的增長,頸椎體內(nèi)鈣化沉積物增多,從而產(chǎn)生脊髓壓迫[6]。該模型能較好地模擬慢性椎間盤突出、黃韌帶肥厚等疾病的自然病程,是一種較為理想的慢性壓迫性脊髓損傷實(shí)驗(yàn)動物模型。

3.3 鉗夾型脊髓損傷模型 有學(xué)者將該方法納入脊髓壓迫模型,因其可行壓迫后減壓,故將其單獨(dú)提出。Rivlin等使用改裝的動脈瘤夾,直接鉗夾脊髓,可以反映不同鉗夾力、不同的壓迫時間與脊髓損傷程度的關(guān)系[7]。Sheng等制備了微創(chuàng)的鼠脊髓損傷模型,通過切開棘間韌帶暴露硬膜外隙,而不進(jìn)行椎板切除,垂直于脊髓縱軸在T11水平的硬膜外隙放置1.5 mm的硅膠管;在放置硅膠管之前,用縫合線穿過硅膠管;在脊髓壓迫之后的1、30、60和120 min的時候,撤除硅膠管。在損傷后 1、3、7和14 d評測神經(jīng)系統(tǒng)功能并進(jìn)行組織學(xué)分析。BBB運(yùn)動評分等隨時間而逐漸惡化,組織學(xué)分析表明,腹側(cè)角的正常神經(jīng)元逐漸減少,細(xì)胞壞死橫斷面積增加[8]。其后李剛等用動脈瘤夾建立模型,造成接近于日常生活中人體脊髓損傷的類型[9],在研究脊髓損傷后急性期的病理生理變化、解除鉗夾壓迫的時機(jī)及電刺激和神經(jīng)保護(hù)性干預(yù)等方面具有重要作用。制作該模型的關(guān)鍵是鉗夾的部位與壓力大小的確定。此類模型多為閉合性損傷,但為非瞬間損傷,既有機(jī)械壓迫所致的原發(fā)性損傷,又有受壓后引發(fā)的繼發(fā)性損傷,與臨床較為相似,便于進(jìn)行神經(jīng)功能和代謝改變的研究和檢測[10]。

3.4 脊髓橫斷損傷 脊髓組織在解剖學(xué)上的連接中斷為橫斷損傷,見于嚴(yán)重的鈍性打擊傷、切割傷及火器傷。隨著對中樞神經(jīng)損傷后修復(fù)的重新認(rèn)識,越來越多的學(xué)者致力于脊髓損傷后神經(jīng)再生的有關(guān)研究,進(jìn)行了大量的動物試驗(yàn),主要采用銳利的刀片選擇性將脊髓進(jìn)行全橫切、半橫切、部分切斷或造成塊狀缺損,形成脊髓橫斷性、半橫斷損傷或脊髓缺損,從而觀察損傷軸突再生、突觸重建及有關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)營養(yǎng)因子、神經(jīng)組織、細(xì)胞移植對這一過程的影響及作用。脊髓橫斷損傷特點(diǎn)在于傷口整齊,出血較少,且操作簡便、重復(fù)性好,損傷程度較恒定,解剖定位準(zhǔn)確,功能障礙亦確定,便于進(jìn)行脊髓損傷的基礎(chǔ)理論研究和神經(jīng)生物學(xué)的研究。尤其是半橫斷損傷還可以與健側(cè)對照,具有獨(dú)特的優(yōu)越性。但該模型損傷硬脊膜,破壞了相對獨(dú)立的中樞環(huán)境,與臨床相關(guān)性差,難以復(fù)制出與臨床相似、可量化的脊髓損傷模型,且死亡率較高。

3.5 脊髓牽拉損傷實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?脊柱過度牽拉致脊髓損傷最早發(fā)現(xiàn)于脊柱側(cè)彎矯形術(shù)中,以醫(yī)源性多見。脊髓牽拉損傷模型用牽開器由側(cè)方牽拉脊髓,實(shí)現(xiàn)水平方向上的脊髓牽拉損傷;選用不同的牽拉比率可以復(fù)制出不同程度的牽拉性脊髓損傷。此模型模擬了臨床狀態(tài)下脊髓損傷的致傷條件和受傷機(jī)制。Dolan等設(shè)計特殊牽拉裝置,固定損傷點(diǎn)上、下椎體并向相反方向牽拉脊柱,結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著牽開距離的增大,脊髓損傷的程度逐漸增加,損傷區(qū)血流逐漸減少,表明損傷區(qū)缺血是脊柱過度牽拉導(dǎo)致脊髓功能喪失的主要原因[11]。周子強(qiáng)等用模擬神經(jīng)拉鉤特制的牽開器由側(cè)方牽拉脊髓,實(shí)現(xiàn)水平方向上的脊髓牽拉性損傷[12]。此模型成功模擬了臨床狀態(tài)下脊髓損傷的致傷條件和受傷機(jī)制,不足之處是由于動物個體耐受不一致,因而牽拉比率的精確性難以控制。

3.6 脊髓缺血性損傷 實(shí)驗(yàn)表明,脊髓損傷除了原發(fā)性機(jī)械因素外,創(chuàng)傷后的脊髓缺血缺氧造成的繼發(fā)性細(xì)胞損害是導(dǎo)致原本可逆的感覺運(yùn)動功能障礙轉(zhuǎn)變?yōu)橛谰眯缘墓δ軉适У闹饕?。研究者對脊髓缺血損傷模型做了大量的研究,主要方法是夾閉動脈。Zivin等對兔腎動脈水平的腹主動脈用Scoville-Lewis動脈瘤夾夾閉的方法制作了脊髓損傷模型[13]。此方法建立模型簡單,具有高度的可重復(fù)性,模型可以長期進(jìn)行臨床跟蹤,功能喪失固定,不發(fā)生驚厥。此種模型特別適合應(yīng)用于神經(jīng)化學(xué)、神經(jīng)病理學(xué)和神經(jīng)生理學(xué)的研究。除了夾閉主動脈外,還有可以制備不同損傷程度的可復(fù)制的脊髓缺血性損傷模型方法——球囊阻塞法。1997年,Kanellopoulos即用這種方法阻塞大鼠近端胸降主動脈,成功制作了脊髓缺血性損傷模型[14]。其后Lazdunski首次用小鼠成功建立了脊髓缺血性損傷模型[15]。鉗閉小鼠主動脈弓、左鎖骨下動脈和乳房內(nèi)動脈,之后再灌注。應(yīng)用小鼠制作此種脊髓損傷模型成本低,然而,但在制作模型時小鼠會產(chǎn)生腸缺血,使在評價神經(jīng)保護(hù)藥物藥效方面的應(yīng)用受到限制。

除此之外,還有脊髓震蕩型損傷模型[16]、光化學(xué)誘導(dǎo)型脊髓損傷模型[17]等,由于與臨床自然病程有一點(diǎn)差距,就不再贅述。近年來脊髓損傷模型的構(gòu)建方法不斷改進(jìn),發(fā)展出多種造模方法,但主要是機(jī)械方法造成脊髓損傷。對于造模方法的改進(jìn)也主要集中在這些機(jī)械方法如何能夠更加標(biāo)準(zhǔn)化以減少模型間差異,如何能夠更加準(zhǔn)確地定位損傷部位,如何使模型損傷程度得到更好的控制,以及提高可重復(fù)性的問題上。

4 小結(jié)

建立理想的動物模型是研究脊髓損傷的基本條件,只有在相同的動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜅l件下,才能更好地研究脊髓損傷機(jī)制,觀察損傷后病理生理改變,從而找出可靠的、靈敏的可直接判斷脊髓損傷程度的方法,以及優(yōu)選出治療脊髓損傷的最佳方案。目前在脊髓損傷的實(shí)驗(yàn)研究中,動物模型種類較多,每種模型僅能代表脊髓損傷的某一方面,各有其優(yōu)缺點(diǎn)。今后研制動物模型應(yīng)在模擬臨床損傷機(jī)制的基礎(chǔ)上,盡量簡化操作步驟,制造出更加接近疾病的自然進(jìn)程、更加可靠、更加標(biāo)準(zhǔn)化、可調(diào)控、可復(fù)制的脊髓損傷模型?？傊?我們在制備脊髓損傷模型時,要根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮途唧w的實(shí)驗(yàn)條件做出科學(xué)的選擇。

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