神經(jīng)營養(yǎng)素-3修復(fù)脊髓損傷的研究進(jìn)展

黨彥麗,李俊岑,楊拯,田蕓,張曉

脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)后脊髓的修復(fù)重建是一個(gè)研究難題。目前的研究表明,脊髓損傷后神經(jīng)營養(yǎng)因子缺乏是導(dǎo)致脊髓損傷后功能恢復(fù)差的重要原因之一,神經(jīng)營養(yǎng)素-3(neurotrophin-3,NT-3)是神經(jīng)營養(yǎng)素家族的重要成員,具有廣泛的生理學(xué)作用。近年來眾多學(xué)者表明NT-3在神經(jīng)損傷的修復(fù)方面起著重要的作用,對脊髓損傷的修復(fù)有很好的效果。

1 NT-3的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)作用

NT-3是由Ernfors等于1990年發(fā)現(xiàn)的繼神經(jīng)生長因子(NGF)和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)之后神經(jīng)營養(yǎng)素家族的重要成員,它是一種小分子量的堿性蛋白質(zhì)。成熟的NT-3由119個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成,有6個(gè)保守的半胱氨酸并形成3對二硫鍵,保守序列集中在半胱氨酸附近[1]。

NT-3的功能部位存在于周圍神經(jīng)系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)的不同部位與腸神經(jīng)系統(tǒng)[2]。它的作用廣泛:①促進(jìn)神經(jīng)元的生長、發(fā)育、分化和成熟,對多種神經(jīng)元具有神經(jīng)保護(hù)和營養(yǎng)作用;②阻止胚胎期及出生后運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞死亡,維持損傷脊髓神經(jīng)元的存活,促使軸突延伸,提高神經(jīng)細(xì)胞軸突再生的內(nèi)在再生能力;③促進(jìn)脊髓損傷后皮質(zhì)脊髓束纖維、背柱感覺傳導(dǎo)纖維及背根節(jié)纖維的出芽和再生;④促進(jìn)再生軸突的髓鞘化[3],減慢橫切損傷脊髓神經(jīng)元死亡速度[4];⑤選擇性的加強(qiáng)脊髓神經(jīng)元的存活和生長發(fā)育[5]。此外,外源性的N T-3可阻止皮層運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元、紅核、背核及脊髓感覺投射神經(jīng)元軸突離斷后的凋亡,促進(jìn)其存活。

2 NT-3多途徑修復(fù)SCI

2.1 基因移植 目前,在基因移植修復(fù)SCI方面,研究最廣泛的主要是NT-3與神經(jīng)干細(xì)胞聯(lián)合移植和N T-3與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合移植修復(fù)脊髓損傷。

2.1.1 NT-3與神經(jīng)干細(xì)胞聯(lián)合移植 神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells,NSCs)存在于成年哺乳動(dòng)物的脊髓、海馬和室管膜下層。它具有自我復(fù)制和多向分化潛能[6],經(jīng)多次分裂后仍能穩(wěn)定地保持自身的特性。

單純移植NSCs能促進(jìn)脊髓損傷后受損傷神經(jīng)元的存活與神經(jīng)纖維再生,但是單純移植NSCs引起的神經(jīng)元存活與軸突再生是有限的。NT-3不僅能防止脊髓損傷后神經(jīng)元的萎縮,促進(jìn)受損傷的上行和下行軸突再生[7,8],還具有促進(jìn)NSCs向神經(jīng)元分化的作用[9]。NSCs移植到損傷后的脊髓中能夠存活并保持增殖活性,分化為神經(jīng)元,從而替代死亡的宿主神經(jīng)元,并可能與損傷處兩端的神經(jīng)突起形成突觸聯(lián)系[10],以橋接的方式促進(jìn)神經(jīng)通路的重建。Himes等的研究表明,將編碼神經(jīng)營養(yǎng)素-3的基因片段導(dǎo)入NSCs,使其在移植部位進(jìn)行表達(dá),改善局部微環(huán)境,可促進(jìn)失突觸神經(jīng)元的生存和增殖[11],進(jìn)而促進(jìn)損傷脊髓的功能恢復(fù)[12]。Blesch等應(yīng)用NT-3基因修飾NSCs,移植入大鼠C3損傷SCI動(dòng)物模型中,2周后發(fā)現(xiàn)相對于未修飾的NSCs移植組,NT-3基因修飾組可見高水平的神經(jīng)生長因子(NGF)及腦源神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)的分泌,以及大量感覺神經(jīng)投射形成,并且60%分化為神經(jīng)元,3%分化為膠質(zhì)細(xì)胞[13]?？梢?NT-3基因修飾的NSCs移植不僅可替代因損傷而發(fā)生死亡的神經(jīng)元,而且還可以分泌促進(jìn)神經(jīng)元存活及軸突再生的神經(jīng)營養(yǎng)因子。

2.1.2 NT-3與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合移植 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)是一種骨髓中造血的結(jié)構(gòu)性和功能性支持細(xì)胞,能分泌多種生長因子,對多種組織起支持作用。BMSCs能夠自我復(fù)制、自我更新,特性穩(wěn)定,連續(xù)傳代培養(yǎng)和冷凍保存后仍具有多向分化潛能[14]。目前認(rèn)為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療脊髓損傷的機(jī)制可能為:①分泌多種神經(jīng)營養(yǎng)因子,改善脊髓局部微環(huán)境并啟動(dòng)再生相關(guān)基因的順序表達(dá),從而促進(jìn)軸突的再生。②使損傷的脫髓鞘軸索再髓鞘化。③橋接脊髓損傷斷端,形成功能性突觸,重新建立神經(jīng)傳導(dǎo)通路[15]。將BMSCs直接植入到標(biāo)準(zhǔn)化的脊髓損傷模型中,可分化為具有神經(jīng)元或膠質(zhì)細(xì)胞特征的細(xì)胞[16],促進(jìn)功能的恢復(fù)[17]。

Lauren等在定量分析BMSCs分泌的神經(jīng)營養(yǎng)因子中,發(fā)現(xiàn)包括BDNF和NGF在內(nèi)的許多神經(jīng)營養(yǎng)因子,而未檢測到NT-3的表達(dá)[18]。為了將BMSCs和NT-3有效地結(jié)合起來運(yùn)用到脊髓損傷的治療中,有實(shí)驗(yàn)研究[19]根據(jù)BMSCs能很好地結(jié)合到中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷部位的特點(diǎn),把BMSCs作為一個(gè)理想的載體細(xì)胞,將神經(jīng)營養(yǎng)因子靶向脊髓[20]。NT-3基因在脂質(zhì)體的介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染到體外培養(yǎng)的大鼠BMSCs中,從而使BMSCs攜帶NT-3基因,觀察靶細(xì)胞中NT-3基因的表達(dá)水平。研究表明,BMSCs可穩(wěn)定、高效表達(dá)外源基因,并于轉(zhuǎn)染后的BMSCs中檢測到NT-3蛋白的表達(dá)。表達(dá)的NT-3可促進(jìn)神經(jīng)元的存活,誘導(dǎo)內(nèi)源細(xì)胞增殖和促進(jìn)神經(jīng)纖維的再生[21]。軸突再生是神經(jīng)修復(fù)的重要組成,移植BMSCs就像“橋梁”一樣為軸突的再生提供支架,或引導(dǎo)、趨化軸突向前生長,抑制膠質(zhì)細(xì)胞、防止瘢痕修復(fù),讓再生的神經(jīng)元軸突順利通過損傷處,使損傷神經(jīng)軸索再髓鞘化[22],為損傷脊髓的兩側(cè)殘端建立新的突觸聯(lián)系創(chuàng)造條件,重建神經(jīng)通路[23]。NT-3與BMSCs聯(lián)合移植的成功為脊髓損傷的修復(fù)奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

2.2 載體介導(dǎo) 載體介導(dǎo)的基因治療,是在體外將目的基因?qū)脒m當(dāng)?shù)囊浦布?xì)胞后,篩選出能夠高效表達(dá)目的基因的移植細(xì)胞并移植到體內(nèi)靶組織,通過提高局部NT-3的濃度,促進(jìn)脊髓損傷的恢復(fù)。

2.2.1 病毒載體介導(dǎo) 病毒載體包括單純皰疹病毒(HSV)、腺病毒(Adv)、腺相關(guān)病毒(AAV)和慢病毒(Lv)載體[24]。由于Adv載體可以攜帶多種神經(jīng)營養(yǎng)因子基因并有效地轉(zhuǎn)染神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞,所以應(yīng)用較為廣泛[25]。將攜帶膠質(zhì)源性的NT-3重組腺病毒轉(zhuǎn)入鼠脊髓橫斷損傷的后肢骨骼肌中,結(jié)果在腰段脊髓的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中發(fā)現(xiàn)攜帶膠質(zhì)源性的NT-3表達(dá),并保護(hù)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元免于軸突斷裂誘發(fā)的細(xì)胞死亡[26]。在SCI的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型中,將帶有NT-3基因的重組腺病毒微注射入周圍神經(jīng)段中移植到脊髓半橫貫損傷處形成“再生橋”,可見有相當(dāng)多的神經(jīng)元重新長出皮質(zhì)脊髓束到損傷處或損傷處遠(yuǎn)端,有明顯的后肢功能恢復(fù)[27,28]。但是,病毒載體都有一個(gè)共同的缺陷在于會(huì)產(chǎn)生免疫反應(yīng)或細(xì)胞毒性,甚至致癌[29]。考慮到病毒載體的局限性,目前非病毒載體的研究倍受人們的關(guān)注。

2.2.2 非病毒載體介導(dǎo) 非病毒載體可以克服病毒載體的缺陷,具有低細(xì)胞毒性和低免疫反應(yīng)等特性。Wu Jun[30]等利用NT-3基因非病毒載體轉(zhuǎn)染嗅鞘細(xì)胞,結(jié)果表明非病毒載體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染細(xì)胞很安全,并且能夠高效能的表達(dá)NT-3,同時(shí)促進(jìn)軸突向外生長來增強(qiáng)脊髓損傷修復(fù)。因此,非病毒載體可以廣泛地運(yùn)用到臨床研究中,以彌補(bǔ)病毒載體的不足。

2.3 克隆 由于NT-3在組織中含量極微以及分布不均,要獲得大量NT-3通過組織提取還有一定的困難,并且很昂貴,因此采用克隆的方法為NT-3治療脊髓損傷帶來新的曙光。陳昌杰等從人腦基因組DNA獲取NT-3,并對其進(jìn)行基因測序,然后運(yùn)用基因工程的方法在體外克隆出大量的NT-3,導(dǎo)入損傷部位進(jìn)行修復(fù)[31]。鄧興力等應(yīng)用RT-PCR成功從大鼠腦組織中克隆出NT-3 cDNA,然后運(yùn)用基因重組技術(shù)將其插入質(zhì)粒載體構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒,植入損傷部位使其表達(dá)達(dá)到治療效果[32]。因此,通過克隆使NT-3廣泛地存在于損傷部位可以有效促進(jìn)脊髓再生,從而加快功能的恢復(fù)。

2.4 直接注射 逆向運(yùn)輸?shù)纳窠?jīng)營養(yǎng)因子缺乏是造成周圍神經(jīng)損傷時(shí)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元死亡的主要原因之一[33],而NT-3能夠減少神經(jīng)元的死亡。由于此種疾病需要長期用藥,所以,能使脊髓前角神經(jīng)元長期表達(dá)成為一種行之有效的辦法。李志全[34]等根據(jù)脊髓直接注射可以減輕神經(jīng)根撕脫傷[35],將重組的NT-3直接注入損傷部位,使其在局部持續(xù)表達(dá),通過影響超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)的表達(dá)來達(dá)到保護(hù)神經(jīng)元的目的[36]。研究表明此種方法對脊髓神經(jīng)元的存活和再生具有雙重作用。

2.5 督脈電針治療 督脈電針治療能夠增高脊髓損傷處鄰近組織的N T-3水平,但其作用機(jī)制目前尚不清楚。有人推測,其機(jī)制可能是激活了宿主脊髓組織的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元的NT-3表達(dá)所致[37]。有研究用電針作用于脊髓部分背根切除術(shù)的大鼠,觀察到鄰近保留背根的背根節(jié)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元的N T-3 mRNA及其蛋白表達(dá)都有增加[38]。

3 展望

大量文獻(xiàn)已經(jīng)表明NT-3對脊髓損傷修復(fù)的促進(jìn)作用,因此,通過補(bǔ)充神經(jīng)營養(yǎng)素-3來治療脊髓損傷成為一種行之有效的方法。不同的治療途徑往往會(huì)對神經(jīng)元的存活和再生起到不同的效果,從而影響修復(fù)的效果?；蛑委熓且环N重要手段,在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中已取得好的效果,但由于安全性的問題還沒有進(jìn)行脊髓損傷方面的臨床試驗(yàn)。相信隨著研究的深入會(huì)有很好的臨床應(yīng)用前景。

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