乳腺癌研究及治療新靶點(diǎn)—乳腺癌干細(xì)胞的研究進(jìn)展

劉為軍 王昆華 龔昆梅 張勇學(xué)

云南省第一人民醫(yī)院普外一科，昆明醫(yī)學(xué)院附屬昆華醫(yī)院，云南 昆明 650032

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤［1］。約有50%的乳腺癌患者經(jīng)手術(shù)治療后可治愈，其他患者在治療后5年內(nèi)出現(xiàn)復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移而導(dǎo)致治療失敗，且復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者死亡的主要原因。隨著人們對(duì)乳腺癌發(fā)生、發(fā)展機(jī)制的深入研究，乳腺癌干細(xì)胞日益受到重視。

1 乳腺癌干細(xì)胞基本特征 腫瘤干細(xì)胞學(xué)說(shuō)認(rèn)為，腫瘤組織中的癌細(xì)胞的生物學(xué)特性不盡相同，即腫瘤組織內(nèi)的細(xì)胞本身具有異質(zhì)性，其中一小群細(xì)胞數(shù)目極其稀少，分化緩慢，但其成瘤能力較強(qiáng)，多具有與干細(xì)胞相似的自我更新能力和一定的分化潛能，并表達(dá)某些正常干細(xì)胞相同的細(xì)胞標(biāo)記蛋白。同樣，乳腺癌中也存在著此類細(xì)胞，即所謂的乳腺癌干細(xì)胞（breast cancer stem cells，BCSCs），BCSCs被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生、發(fā)展與維持的基礎(chǔ)，與腫瘤的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和對(duì)治療的耐受有關(guān)。目前研究認(rèn)為只有少數(shù)BCSCs進(jìn)入細(xì)胞周期，而多數(shù)BCSCs處于靜止?fàn)顟B(tài)，故BCSCs對(duì)常規(guī)的化療藥物并不敏感?，F(xiàn)有的物理、化學(xué)藥物治療手段所針對(duì)的是大多數(shù)的腫瘤細(xì)胞，對(duì)腫瘤中少數(shù)的BCSCs無(wú)法達(dá)到最有效的殺滅效果，不能防止惡性腫瘤的復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移，而腫瘤的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移是患者死亡的主要原因。

2 乳腺癌干細(xì)胞標(biāo)志物和高表達(dá)分子

2.1 ESA+CD44+CD24-/low, CD44+CD24-/lowLin-B38.1+ESA+乳腺癌中以CD44+CD24-/low為分子標(biāo)志物的細(xì)胞為乳腺癌干細(xì)胞（breast cancer initiating cells，BRCa IC）。Clarke等［2］首次從人類乳腺癌標(biāo)本中分離出BRCa IC，并把表達(dá)CD44、B38.1和ESA的乳腺癌細(xì)胞移植到NOD/scid小鼠體內(nèi)并生成腫瘤。Al-Hajj等［3］以Lin-ESA+CD44+CD24-/low為特異性乳腺癌干細(xì)胞，證明了表型為L(zhǎng)in-ESA+CD44+CD24-/low的細(xì)胞較表型為L(zhǎng)in-ESA-CD44+CD24+的細(xì)胞在NOD/scid小鼠體內(nèi)具有更強(qiáng)的成瘤能力。Ponti等［4］把乳腺癌組織和乳腺癌的細(xì)胞系中分離出的CD4+CD24-CD43-進(jìn)行體外培養(yǎng)，結(jié)果顯示細(xì)胞呈球狀生長(zhǎng)，并過(guò)表達(dá)血管生成因子、細(xì)胞保護(hù)因子及公認(rèn)的干細(xì)胞標(biāo)志物Oct4。但Abraham等［5］用免疫雙染法檢測(cè)了136例患者石蠟組織切片，發(fā)現(xiàn)CD44+CD24-/low的比例與臨床結(jié)果無(wú)關(guān)，CD44+CD24-/low比例高的乳腺癌更傾向于骨轉(zhuǎn)移，提示對(duì)BRCa IC的標(biāo)志尚需進(jìn)一步細(xì)化及深入研究。

2.2 Wnt、Notch和Hedgehog等信號(hào)通路分子 有證據(jù)表明與乳腺癌形成有關(guān)的信號(hào)通路，如Notch、Shh和Wnt、Hedgehog參與了調(diào)整乳腺癌干細(xì)胞自我更新的過(guò)程。乳腺干細(xì)胞高表達(dá)Notch1、Notch4及其靶基因HESR-1［6］，Notch通路的活化導(dǎo)致了乳腺微球體的形成，卻對(duì)分化細(xì)胞無(wú)作用［7］。Wnt蛋白是細(xì)胞間的信號(hào)分子，正常情況下，該分子調(diào)節(jié)一些器官的發(fā)育，其異常調(diào)節(jié)時(shí)則導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。研究表明，Wnt信號(hào)通路的活化可引起乳腺癌干細(xì)胞的比例增加［8-9］，骨髓中Wnt表達(dá)可能同樣影響 HSCs，使用高度純化的小鼠骨髓HSCs。在長(zhǎng)期的HSCs培養(yǎng)中，激活β-catenin的過(guò)度表達(dá)（一種Wnt的下游激活物）能擴(kuò)增可移植的HSCs［10-12］。Liu等［13］研究發(fā)現(xiàn)，Hedgehog在乳腺癌干細(xì)胞高度表達(dá)，其通道活化后乳腺微球體數(shù)量及體積均增加，同樣提示Hedgehog異常表達(dá)可導(dǎo)致乳腺癌的形成。

2.3 乙醛脫氫酶（aldehyde dehydrogenase, ALDH） ALDH1是細(xì)胞內(nèi)乙醛氧化脫氫酶，可在干細(xì)胞分化早期氧化視黃醇而形成視黃酸，鼠和人類的造血及神經(jīng)干細(xì)胞中ALDH1活性較高［14-15］，Hoechst染色法和ALDH活性已被用來(lái)純化和鑒定鼠和人的造血干細(xì)胞［16-17］。此外，循環(huán)祖細(xì)胞也可用ALDH活性來(lái)鑒定［18］。另一研究顯示ALDH1的表達(dá)可能提示乳腺上皮細(xì)胞具有干細(xì)胞特征。Ginestier等［19］發(fā)現(xiàn)ALDH1活性增加的正常人和癌癥患者的乳腺上皮細(xì)胞具有干/祖細(xì)胞特性。含有高水平的ALDH1的正常乳腺上皮細(xì)胞群能形成乳腺球，從中分離的細(xì)胞能自我更新。ALDH1高活性的乳腺癌細(xì)胞可以重現(xiàn)親代腫瘤的雜合性，表明ALDH1高活性的乳腺癌細(xì)胞也包含干細(xì)胞群。Ginestier等［19］還認(rèn)為ALDH1免疫組織化學(xué)檢測(cè)可用來(lái)鑒別乳腺干細(xì)胞。ALDH1陽(yáng)性細(xì)胞定位于末端導(dǎo)管小葉單位。另一研究認(rèn)為乳腺癌干細(xì)胞定位于乳腺導(dǎo)管［20］。在乳腺癌臨床檢測(cè)中ALDH1的表達(dá)與預(yù)后有關(guān)。

3 乳腺癌干細(xì)胞的分離鑒定

3.1 乳腺癌干細(xì)胞的分離 乳腺癌干細(xì)胞的成功分離是為下一步進(jìn)行乳腺癌干細(xì)胞特性研究的關(guān)鍵步驟。研究者采用各種不同途徑來(lái)分離乳腺癌干細(xì)胞，每種方法各有其利弊。目前比較成熟的方法有2種：流式分選法（fluorescence-activated cell sorting，F(xiàn)ACS）和磁式分選法（magnetic activated cell sorting，MACS）。

3.1.1 FACS

3.1.1.1 利用干細(xì)胞通用分子標(biāo)記ABCG2進(jìn)行分選 三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體（ATP-binding cassette super family G member 2，ABCG2），基因在多種來(lái)源的干細(xì)胞膜均有表達(dá)，而在大多數(shù)成熟細(xì)胞中不表達(dá)。在乳腺癌干細(xì)胞中同樣高表達(dá)ABCG2，其高表達(dá)細(xì)胞高效外排DNA熒光染料Hoechst33342，從而能用流式分選出側(cè)群（side population，SP）干細(xì)胞。Patrawala等［21］利用此法成功分離出乳腺癌干細(xì)胞。

3.1.1.2 利用干細(xì)胞表面一些膜蛋白來(lái)分選 乳腺癌干細(xì)胞可利用CD44和CD24［4］分子來(lái)分選，Li等［22］采用懸浮培養(yǎng)結(jié)合化療藥物分類的方法分離能產(chǎn)生新腫瘤的單個(gè)乳腺癌干細(xì)胞，將TMD40小鼠乳腺癌細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)，通過(guò)流式細(xì)胞儀測(cè)試CD44和CD24的表達(dá)，用抗癌劑紫杉醇和多柔比星處理細(xì)胞，快速殺死處于分裂期的癌細(xì)胞，留下相對(duì)靜止的乳腺癌干細(xì)胞。

3.1.1.3 利用乳腺癌干細(xì)胞中ALDH的含量較高的特性進(jìn)行分選 ALDH是存在于細(xì)胞液中的一種氧化還原酶，主要對(duì)細(xì)胞內(nèi)的醛進(jìn)行氧化，在乙醇和維生素A的氧化及環(huán)磷酰胺耐藥中均有重要作用。

最近有研究中發(fā)現(xiàn)，高ALDH活性的正常乳腺上皮細(xì)胞具有干細(xì)胞的特性，可在NOD/scid小鼠體內(nèi)形成乳球和導(dǎo)管小葉結(jié)構(gòu)［23］。在人類乳腺癌的異種移植中，ALDH+的細(xì)胞也具有腫瘤干細(xì)胞的特征：約占細(xì)胞總數(shù)的1%～10%，致瘤性很強(qiáng)，200個(gè)ALDH+的細(xì)胞即可在NOD/scid小鼠體內(nèi)形成腫瘤，且新形成的轉(zhuǎn)移瘤中具有與原發(fā)腫瘤相同的ALDH基因表達(dá)圖譜，但2×103個(gè)ALDH-細(xì)胞也不能形成轉(zhuǎn)移瘤。此外，利用腫瘤組織的微陣列分析也發(fā)現(xiàn)ALDH+的乳腺癌臨床預(yù)后差。目前臨床上使用測(cè)定ALDH的活性為乳腺癌的早期發(fā)現(xiàn)提供有力支持。

3.1.2 MACS磁珠系統(tǒng) MACS利用未標(biāo)記的CD分子的單克隆抗體作為一抗與單細(xì)胞懸液溫育后，再與免疫磁珠標(biāo)記的二抗結(jié)合，當(dāng)這種特異性一抗、二抗標(biāo)記的細(xì)胞懸液流過(guò)特制的永久磁鐵的磁場(chǎng)時(shí)，可吸附在磁式分選柱內(nèi)，再將磁式分選柱移開磁場(chǎng)并從柱內(nèi)洗脫，從而收集干細(xì)胞。

3.2 乳腺癌干細(xì)胞的鑒定 當(dāng)前，從形態(tài)學(xué)方面對(duì)乳腺癌干細(xì)胞進(jìn)行鑒定較為困難，只能從功能學(xué)方面進(jìn)行分析。

3.2.1 利用腫乳腺癌干細(xì)胞的生物學(xué)特性在體外培養(yǎng)進(jìn)行初步的鑒定 即體外培養(yǎng)的乳腺癌干細(xì)胞是否呈懸浮球狀生長(zhǎng)，是否具有自我更新和增殖能力以及是否具多向分化潛能。目前有研究［24］表明：乳腺癌干細(xì)胞易呈懸浮球狀生長(zhǎng)并可連續(xù)傳代，在傳代的后期更易出現(xiàn)懸浮球狀生長(zhǎng)且增殖速度加快；此外，通過(guò)有限稀釋實(shí)驗(yàn)和亞克隆培養(yǎng)分析發(fā)現(xiàn)所有親本腫瘤球制成的細(xì)胞懸液都再次形成腫瘤球，且與親本腫瘤球完全相同，提示乳腺癌干細(xì)胞具有自我更新和增殖能力；將乳腺癌干細(xì)胞轉(zhuǎn)移至含血清的培養(yǎng)液中培養(yǎng)7 d左右，便不再或極少表達(dá)Nestin和CD133，而這2種標(biāo)記物現(xiàn)在普遍被認(rèn)為在干細(xì)胞或是祖細(xì)胞中表達(dá)，表明了干細(xì)胞具有多向分化的潛能。但這些方法只能初步鑒定乳腺癌干細(xì)胞。

3.2.2 測(cè)定體外克隆形成能力鑒定乳腺癌干細(xì)胞 即將初步鑒定出的乳腺癌干細(xì)胞在NOD/scid小鼠體內(nèi)重建模型，從而觀察其致瘤性，此種方法被認(rèn)為是目前進(jìn)行腫瘤干細(xì)胞鑒定的最具說(shuō)服力的方法。

3.2.3 鑒定乳腺癌干細(xì)胞的新方法—應(yīng)用ALDEFLUOR試劑檢測(cè) 美國(guó)密歇根大學(xué)綜合癌癥中心的研究人員最近又發(fā)現(xiàn)一種鑒定乳腺腫瘤干細(xì)胞新方法［25］，這項(xiàng)發(fā)現(xiàn)不僅為確定乳腺癌治療最佳方案提供了一種簡(jiǎn)單診斷方法，還強(qiáng)有力地支持了癌癥干細(xì)胞學(xué)說(shuō)。研究人員利用名為ALDEFLUOR的試劑來(lái)檢測(cè)細(xì)胞中的ALDH活性。表達(dá)高水平ALDH的細(xì)胞會(huì)發(fā)出熒光并且能夠被檢測(cè)到。隨后，細(xì)胞被分選并與被染色細(xì)胞分離。在此過(guò)程中，研究人員發(fā)現(xiàn)ALDEFLUOR試劑檢測(cè)陽(yáng)性細(xì)胞的行為與干細(xì)胞相同，而檢測(cè)結(jié)果為陰性細(xì)胞則明顯不同。

4 乳腺癌干細(xì)胞在乳腺癌治療中的應(yīng)用 現(xiàn)有的乳腺癌治療方法多旨在盡可能殺死或清除一切腫瘤細(xì)胞［26］。但是對(duì)存在于腫瘤中的數(shù)量稀少的干細(xì)胞樣細(xì)胞群卻作用甚微，治療后殘存腫瘤干細(xì)胞的增殖，足以促使腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。

乳腺癌復(fù)發(fā)被認(rèn)為是由于非分裂的乳腺癌干細(xì)胞具有抗藥性。比如，大多數(shù)與BRCA21基因相關(guān)的乳腺癌在解除鉑類化療藥物治療2～3個(gè)月后獲得抗鉑性［27］。對(duì)這些腫瘤細(xì)胞分析發(fā)現(xiàn)，與原發(fā)性腫瘤移植相比，CD29highCD-24med細(xì)胞群在鉑類藥物難治性繼發(fā)腫瘤移植中顯著增加，從6.6%～11.0%增加至16.5%～29.2%。這表明克隆演變和乳腺癌干細(xì)胞擴(kuò)增可能是化療耐藥的一個(gè)原因。免疫療法是另一種用來(lái)消除乳腺癌干細(xì)胞群的治療方法［28］。

Li等［29］研究顯示添加突變r(jià)h471 TNF2α到MCF7亞群(乳腺癌干細(xì)胞標(biāo)記陽(yáng)性)可促進(jìn)細(xì)胞凋亡和降低自我更新的能力。突變r(jià)h471 TNF2α可負(fù)性調(diào)節(jié)乳腺癌干細(xì)胞，也有可能被應(yīng)用于乳腺癌治療。Piyush等［30］發(fā)現(xiàn)鹽霉素殺死乳腺癌干細(xì)胞的能力比普通的化療藥物如紫杉醇強(qiáng)100倍。與被紫杉醇處理過(guò)的腫瘤干細(xì)胞相比，經(jīng)過(guò)鹽霉素處理過(guò)的腫瘤干細(xì)胞被注入到實(shí)驗(yàn)鼠體內(nèi)后，成瘤幾率顯著降低，且實(shí)驗(yàn)鼠腫瘤的生長(zhǎng)速度也明顯減慢。

5 展望 總之，乳腺癌干細(xì)胞理論為根治乳腺癌開辟了新的治療途徑，腫瘤治療研究開始以特異性乳腺癌干細(xì)胞為主要目標(biāo)，即從源頭上根治腫瘤。發(fā)現(xiàn)和闡明乳腺癌干細(xì)胞增殖過(guò)程中的基因調(diào)控機(jī)理，將為抗腫瘤藥物的研發(fā)提供新的靶點(diǎn)，針對(duì)乳腺癌干細(xì)胞的新一代特異性強(qiáng)的抗腫瘤生物及免疫藥物有望極大地提高腫瘤的治療效果。

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